實時剪切彈性波成像對不同原因兔脂肪肝肝臟硬度的評價

湯躍躍 周虹 張勇 李云燕 徐麗榮 陸永萍

云南省第二人民醫院 1超聲科，2病理科（昆明650021）

近年來，脂肪性肝病的發病率逐年上升，如果不及時控制，脂肪性肝病經過纖維化期，最后也會發展為肝硬化［1-2］。近年來發展起來的超聲彈性成像新技術，能夠獲取組織彈性信息［3-5］，評價組織的軟硬度，在肝臟疾病的診斷中成為熱門話題。酒精及高脂飲食均可導致脂肪肝的發生［6］，并引起肝臟纖維化的改變，但兩種因素導致的肝臟損傷病理及程度如何？本研究模擬人類的不良飲食，制備兔的脂肪肝模型，應用目前最新的實時剪切波彈性成像技術對不同類型的兔脂肪肝進行肝纖維化檢測，探討不同原因導致的脂肪肝的損傷情況和在形成過程中肝臟硬度的發展趨勢。

1 材料與方法

1.1 動物分組 選取雄性日本大耳白兔60只（由昆明醫科大學實驗動物科提供），兔齡15～35 d，體質量1.5～2.52 kg，隨機分3組，每組20只。單純性脂肪肝組：高脂飼料喂養（配方：膽固醇2%，牛油10%，白糖5%，蛋黃粉8%，基礎飼料75%）［7］。酒精性脂肪肝組：常規飼料（基礎飼料喂養），每天10 mL 50°白酒灌注2次（由昆明江銳生物科技有限公司提供），自由飲水。正常組：常規飼料（基礎飼料喂養），以上飼料均由昆明醫科大學實驗動物科加工。

1.2 實驗方法 3組兔均喂養12～20周，于喂養0、12、16及20周進行一次觀察。觀察前禁食12 h，稱量體質量，對兔進行常規超聲觀察，并進行彈性成像檢查。采用法國Supersonic Imagine公司的ShearWaveTM實時剪切波彈性成像超聲診斷儀測量兔肝臟彈性模量值（最大值Max、平均值Mean、最小值Min、彌散度Sd等），反映其硬度。每只兔子重復測量3次，記錄并計算3次測量值的平均值。定量測試區域Q?BOX內顏色完全充滿，圖像均勻、無雜色為取樣成功。取樣成功后處死動物，進行病理切片。

模擬時段設定：本次模擬自廢渣填埋場建成開始運營起，總共模擬7 200 d(20 a)，時間步長為50 d，總共144步，模擬得出污染物濃度時空變化過程。

1.3 病理分析 處死動物后取動物肝臟進行免疫組化染色。HE染色：顯微鏡下觀察兔肝臟脂肪變占肝細胞面積的比例，組織學上每單位面積發現1/3以上肝細胞脂肪變性時，稱為脂肪肝［8］。天狼猩紅染色：根據組織切片的結果，參照METAVI組織半定量評分系統并結合2000年《病毒性肝炎防治方案》的診斷標準對肝纖維化分期進行評估：0級無纖維化；Ⅰ級匯管區纖維化擴大，局限竇周及小葉內纖維化；Ⅱ級匯管區周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉保留；Ⅲ級纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；Ⅳ級早期肝硬化。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，2組間參數比較采用t檢驗，組間比較行單因素方差分析；P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.4 纖維化S分期與彈性模量值比較 各S分期間彈性模量值Mean比較，差異有統計學意義，隨著S分期的增高，Mean值也呈增高趨勢（P＜0.05）。見表2。

2 結果

2.2 3組兔肝臟彈性模量值比較 12周及以后，單純性脂肪肝組、酒精性脂肪肝組彈性模量值（Max、Mean）均高于正常組，酒精性脂肪肝組又高于單純性脂肪肝組（均P＜0.05）。而3組彈性模量值Min比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（圖1）。

2.1 一般情況 12周時，單純性脂肪肝組及酒精性脂肪肝組常規超聲檢查均見脂肪肝改變。20周時，正常組20只兔均存活，常規超聲觀察未見脂肪肝改變。單純性脂肪肝組兔存活16只，死亡原因可能為對高脂肪飼料不耐受，腹瀉致死。酒精性脂肪肝組兔存活12只，其中3只肝硬化并伴腹水，死亡原因為灌胃時酒精誤吸入氣管導致肺炎以及酒精中引起的中樞神經抑制或肝衰竭。

不同喂養時期單純性脂肪肝組及酒精性脂肪肝組彈性模量值Mean比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；正常組不同時期彈性模量值Mean比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

試驗通過油紅O染色檢測分析了線蟲體內脂肪的變化情況。圖6結果可以直觀的顯示，試驗組線蟲的脂肪含量明顯要低于對照組，且隨著L-阿拉伯糖濃度的不斷增加脂肪含量逐漸減少。這一試驗結果和甘油三酯含量測定結果相同，進一步說明L-阿拉伯糖具有明顯的降低脂肪合成作用，具有一定的降脂功效。

表1 3組兔肝臟不同時期彈性模量值比較Tab.1 Comparison of the measured elasticity of the rabbit liver in 3 groups during different periods ±s

表1 3組兔肝臟不同時期彈性模量值比較Tab.1 Comparison of the measured elasticity of the rabbit liver in 3 groups during different periods ±s

注：與正常組比較，*P＜0.05；與單純性性脂肪肝比較，#P＜0.05

組別正常組單純性脂肪肝組酒精性脂肪肝組n 20 16 12 0周體質量（kg）1.38±0.11 1.33±0.12 1.35±0.12 Mean（kPa）5.0±0.4 5.2±0.5 5.2±0.5 Max（kPa）14.2±4.2 16.3±5.8 15.4±5.9 Min（kPa）1.9±1.4 2.0±1.1 2.2±1.2 12周體質量（kg）2.25±0.18 2.43±0.17*2.39±0.17*#Mean（kPa）5.5±0.6 8.4±1.2*9.1±1.4*#Max（kPa）17.2±5.6 24.3±6.8 30.3±7.8*#Min（kPa）2.3±1.6 2.9±1.8 4.0±2.0組別正常組單純性脂肪肝組酒精性脂肪肝組n 20 16 12 16周體質量（kg）2.56±0.13 3.05±0.25*2.63±0.48#Mean（kPa）5.8±0.7 11.6±2.4*16.6±4.5*#Max（kPa）18.2±4.8 28.9±6.0*37.5±6.8*#Min（kPa）2.5±1.4 3.8±1.7 4.6±1.7 20周體質量（kg）3.12±0.13 3.53±0.22*2.65±0.17*#Mean（kPa）5.8±0.8 14.5±2.4*20.7±4.5*#Max（kPa）19.2±5.3 30.4±6.3*44.9±6.1*#Min（kPa）2.2±1.4 3.7±1.6 3.4±1.7

（4）在混合料振動壓實時，嚴格控制其碾壓速度，若碾壓速度過小，可能會出現過振現象，易導致骨料出現破碎現象。

2.5 實時剪切波彈性成像診斷肝纖維化的準確性 對所有兔肝按病理S分期與Mean進行ROC曲線分析并初步確定各S分期的診斷界點（表3），S1 ～ S4的Mean分別為7.15、12.5、13.80、18.15 kPa。

對脂肪肝病變進程及程度的定量評價以肝穿的組織學檢查為金標準［9］，但作為有創性的檢查，患者尤其是脂肪肝患者一般不易接受。超聲檢查為初步篩選脂肪肝和脂肪肝藥物療效評價的首選方法［10］。目前常規影像學診斷技術仍無法有效的對脂肪肝進行S分期，因此探索無創性的脂肪肝診斷技術仍是我們共同面臨的挑戰［10］。

2.3 病理切片

圖1 3組兔20周時彈性值Fig.1 2?D images of the liver at the 20th week in three groups

圖2 3組兔肝臟HE染色（×200）Fig.2 HE staining of the liver in the three groups（× 200）

圖3 3組兔肝臟天狼星紅染色（×100）Fig.3 Sirius red staining of the liver in the three groups（× 100）

[7]With such a toxic mix,President Trump―with the crucial mid-term elections approaching―is making a political argument to the voters of Pennsylvania.I will block cheaper steel imports and save jobs.Even if the economics suggest that—in aggregate—the opposite will be the case.（2018.3.5）

表2 3組兔S分期的肝彈性模量值比較Tab.2 The range of S stages in three groups±s

表2 3組兔S分期的肝彈性模量值比較Tab.2 The range of S stages in three groups±s

注：對各S分期之間彈性模量值Mean行方差分析，*P＜0.05

分級n Mean（kPa）S0 S1 S2 S3 S4合計20 6 9 944 8 5.27±1.33 7.21±1.20 12.81±0.72 15.83±1.07 21.12±1.58 11.82±5.53*

2.3.1 HE染色 正常組兔肝小葉結構清晰，肝細胞束排列整齊，細胞無變性、壞死改變，肝實質內未見炎癥細胞浸潤，肝細胞內偶見脂滴，脂肪變面積5%以內。單純性脂肪肝組肝組織內肝細胞腫大、變性、細胞內有大小不等的脂肪空泡，脂肪變面積30%～50%。酒精性脂肪肝組肝細胞內散在大小不均的脂滴，脂滴融合明顯，胞核偏位或脂滴圍繞細胞核，脂肪變面積40%～80%（圖2）。

表3 3組兔各S分期的診斷界值Tab.3 The cut off S stage in three groups of 54 rabbits

3 討論

2.3.2 天狼猩紅染色 天狼猩紅染色顯示正常組兔肝小葉結構清晰，僅在匯管區有極少量膠原沉積；其他兩組可見大量膠原纖維沉積，部分形成纖維間隔，嚴重者偶可見假小葉形成（圖3）。病理分級結果正常組均為0級，單純性脂肪肝組6只為Ⅰ級肝纖維化，8只為Ⅱ級纖維化，2只為Ⅲ級纖維化，肝纖維化主要以Ⅱ、Ⅲ級為主。酒精性脂肪肝組7只為Ⅲ級纖維化，4只為Ⅳ級纖維化，肝纖維化明顯，3只為早期肝硬化并伴腹水。

BAVU等［11］用實時剪切彈性波成像對慢性肝病患者的肝纖維化分型進行評價，結果提示實時剪切彈性波成像可作為一種有效的肝纖維化的常規輔助檢查，并可避免活檢給患者帶來的不適和嚴重的并發癥。葉俊釗等［12］應用實時剪切彈性波成像對256例慢性乙型肝病患者行肝臟纖維化分期，結果與肝穿刺活檢病理結果對照分析，進一步證實實時彈性成像可準確區分顯著纖維化（F2期）和肝硬化（F4期），說明實時剪切彈性波成像可以應用于肝纖維化分期。但目前國內外主要針對慢性肝病患者彈性的研究，仍無關于脂肪肝彈性定量的成熟報道。

本研究發現所有給予不良飲食的兔子在超聲持續觀察下，分別于12周后陸續出現了脂肪肝，隨著不良因素的持續干預，脂肪肝的病變程度逐漸加重，16～20周分別有肝硬化腹水的發生，而以酒精性脂肪肝的變化更明顯。后經病理也證實了超聲所觀察的兔肝臟改變情況。正常組均未出現脂肪及肝纖維化改變，而單純性脂肪肝組及酒精性脂肪肝組均有脂肪改變，單純性脂肪肝組纖維化改變集中在Ⅰ、Ⅱ級，酒精性脂肪肝組在Ⅲ、Ⅳ級，證明酒精性脂肪肝組肝纖維化改變較單純性脂肪肝組重，也印證了脂肪肝病理發展過程，即脂肪肝的發展是從單純性脂肪肝到脂肪性肝炎，最終進展為脂肪性肝硬化的。但也有例外，例如，酒精性脂肪肝可不出現明顯的脂肪性肝炎而直接進展至肝硬化［13］。本研究有3例進入了肝硬化期，考慮為此3例因個體化差異對酒精不耐受，而直接進入肝硬化期。實時剪切波彈性成像的檢測結果表明隨著不良因素（高脂、飲酒）的持續存在，兔肝臟的彈性模量值Mean呈增高趨勢，即肝臟的硬度不斷增加，而酒精性脂肪肝的硬度增長趨勢明顯高于單純性脂肪肝組，同一喂養周期內酒精性脂肪肝的硬度明顯高于高脂組。正常組整個喂養周期內肝臟硬度則無明顯變化。這與病理改變趨勢一致。提示除了傳統的超聲評價，彈性測值可以作為一個動態觀察肝臟損傷的指標。

鑒于Hadoop平臺下作業調度算法在Reduce任務調度方面的不足，本文提出了一種新的任務調度算法，其基本思想在于選擇系統中的最優節點，將特定的Reduce任務調度到最優節點上，從而減少任務的中間數據傳輸時間，省去對數據中心帶寬資源的占用。其中最優節點是指集群中通過網絡鏈路傳輸Map階段中間數據時經過的跳數最少的節點。

當然，本研究有一定的局限性，對兔肝臟彈性及病理對照，是在兔已形成明顯的脂肪肝及酒精肝時進行的，但在脂肪肝形成過程中的病理改變還有待進一步研究。另外，本研究模擬的是兔不良飲食肝臟的改變，由于兔是食草性動物，對高脂與酒精的代謝能力與人類有區別，因此不能完全代表人類脂肪肝的發展進程，有待于對人類相關疾病的具體研究。

綜上所述，實時剪切波彈性成像在肝臟彈性（纖維化程度）的定量中重復性、穩定性好，作為一種無創性的手段，能較客觀地反映肝臟的硬度，能檢測不同病因引起的脂肪肝形成過程中纖維化發展的進程，可廣泛用于臨床工作中［14］。

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