HBx上調TGF?β/TβR?Ⅱ通路對肝細胞癌索拉菲尼耐藥的影響

邢健鸚 何遠學 曾洪蘭 陳家誠 周鈺 沈群 周文珂 陳曉玲葉文玉 武金才

海南省人民醫院1預約診療服務中心，2傳染科，3肝膽外科，4門診部，5膽胰外科（海口570311）

在我國，肝細胞癌是極為常見的一種惡性腫瘤，具有早期診斷率低、進展快與病死率高等特點［1］。特別是多數患者在就診時已為晚期，失去了手術治療機會，大多進行化療。但因為肝細胞癌在早期的診斷率不高，確診時常常已經進入晚期，已然失去根治機會［2-3］。在治療肝細胞癌時，化療能夠對治療起到很好的輔助效果，可是對于化療藥物，肝癌細胞的敏感性較差，極易形成耐藥性。在臨床治療上，索拉菲尼是一種多激酶抑制劑，能夠起到抑制抗血管生成以及腫瘤細胞增殖等作用，在肝細胞癌中的應用多見［4］。但是由于先天或獲得的耐藥性導致索拉菲尼延長肝細胞癌的中位生存期有限，為此需要積極研究肝細胞癌索拉菲尼耐藥的影響機制［5-6］。HBX基因是HBV重要的功能基因，也是乙型病毒性肝炎基因組中的一個多功能反式激活因子，在肝癌細胞中的整合率超過70.0%，是肝癌產生耐藥性的重要原因之一［7］。經過研究發現，HBX基因在整合時能夠利用ERK1/2信號通路在HIF?1α介導下促進多藥耐藥相關基因的轉錄，從而使肝癌細胞獲得多藥耐藥的表型［8-9］。在肝癌細胞細胞通路傳遞中，TGF?β通過受體復合物傳遞信號，輔助受體能促進相關受體復合物的形成，并決定TβR?Ⅱ的特異性，TβR?Ⅱ可通過磷酸化Ⅰ型受體的GS區而激活Ⅰ型受體的激酶活性，然后在肝臟慢性炎癥促進肝癌發生過程中發揮重要作用［10-12］。本課題應用多種方法來探究HBx上調TGF?β/TβR?Ⅱ通路對肝細胞癌索拉菲尼耐藥的影響，具體分析肝癌細胞產生多藥耐藥性的分子機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 穩定轉染HBX蛋白的HepG2?HBx細胞與轉染pcDNA3.1質粒的HepG2?3.1細胞均在本實驗室長期保存及培養，所有細胞均用10%滅活胎牛血清、RPMI1640培養基，在溫度為37℃、5%CO2的恒溫培養箱進行培養。DMEM（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco，USA）、胰蛋白酶（Gibco公司），MTT（Sigma公司），索拉菲尼（Sigma公司），TGF?β、HBx抗體（Cell Signaling Technology，CST）；免疫熒光試劑（Santa Cruz公司）。

1.2 細胞處理 HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞培養于含1 mg/mL G418的完全培養基中，以維持其抗性表型，37℃、5%CO2條件下培養。以含梯度濃度的索拉菲尼的培養基調整細胞濃度為1×105個細胞/孔，培養24 h后接種于96孔中，以含梯度濃度的索拉菲尼的培養基培養72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，孵育4 h后終止培養。每孔加入酸化的DMSO 100 μL，于酶標儀檢測波長為570 nm時的吸光度A值，繪制細胞生長曲線。肝癌細胞抑制率（%）=［（A對照組-A實驗組）/A對照組］×100%，重復3次，然后計算索拉菲尼的IC50值。

1.3 流式凋亡檢測 HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞分別接種于24孔板中后，至80%密度時，分別換用含50 μg/mL的索拉菲尼的完全培養，作用24 h后消化收集細胞，PBS洗滌3次，用annexinV?FITC 結合緩沖液（5 μL annexin V?FITC stock與10 μL PI）重懸細胞，調整細胞密度約5×105/mL左右。室溫下進行10 min孵育，利用流式細胞儀進行檢測，通過運用軟件CellQuest來分析細胞凋亡情況。

1.4 免疫印跡分析 消化收集HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞，用IP裂解液裂解細胞，冰上放置 30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清，裝成小份凍存于-80℃，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行操作，使用GE公司提供的軟件ImageQuant進行灰度掃描和分析，并得出蛋白的相對表達量，以β?actin作為內標。

1.5 統計學方法 在此次實驗中，運用軟件SPSS 20.00展開分析，采用均數±標準差與百分比來描述計量資料與計數資料，計量數據與計數數據的對比為t檢驗與卡方分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥性對比分析 應用免疫印跡技術鑒定HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞的HBX蛋白表達情況，可見HepG2?HBx細胞的HBX蛋白表達明顯高于普通的HepG2?3.1細胞（P＜ 0.05）。見圖1。為研究HBX是否會引起肝癌細胞耐藥性增加，以索拉菲尼處理HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞72 h后再行MTT檢測，結果顯示索拉菲尼對HepG2?HBx細胞的 IC50值為 HepG2?3.1 細胞的4.65倍。

圖1 HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞的HBX蛋白表達Fig.1 The expression of HBX protein in HepG2?HBx cells and HepG2?3.1 cells

2.2 細胞凋亡對比 采用annexinV/PI法比較了HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞的凋亡率，結果顯示索拉菲尼作用24 h后，HepG2?HBx細胞的凋亡率要明顯低于HepG2?3.1細胞的凋亡率（P＜0.05）。見表1。

2.3 耐藥相關蛋白檢測分析 經培養24、48、72 h后的HepG2?HBx細胞與HepG2?3.1細胞進行收集，提取蛋白進行免疫印跡法檢測TGF?β蛋白表達，結果顯示HepG2?HBx細胞較HepG2?3.1細胞的多藥耐藥蛋白TGF?β表達量明顯增高（P＜0.05）。見圖2。

表1 經過索拉菲尼處理的不同細胞的細胞凋亡率對比Tab.1 The rate of cell apoptosis in different cells treated by sorafenib ± s，%

表1 經過索拉菲尼處理的不同細胞的細胞凋亡率對比Tab.1 The rate of cell apoptosis in different cells treated by sorafenib ± s，%

細胞HepG2?HBx細胞HepG2?3.1細胞t值P值n33細胞凋亡率13.56±2.19 4.89±1.63 8.392＜0.05

圖2 耐藥相關蛋白檢測對比Fig.2 Detection and comparison of drug resistance related proteins

3 討論

乙肝是當今主要的傳染病之一，目前全球乙肝患者超過4億人，其中部分患者可發展為肝細胞癌。雖然化療為肝癌的主要治療方法，但是臨床發現肝癌對化療并不敏感，而肝癌組織常表達多藥耐藥基因，這可能與肝癌對化療的低應答有關［13-14］。

HBX感染跟肝細胞癌的形成及發展存在密切關系，在HBV基因組當中，HBX基因是功能基因，能夠發揮重要作用，能直接或間接地在乙肝進展為肝癌時發揮重要影響［15］。在HBV病毒基因組當中，HBV的X基因是最小的開放性讀碼框，全長435～462 bp，編碼長度為154個氨基酸的蛋白（HBx）。經過研究發現，HBx蛋白在NF?κB、TGF?β通路等多條細胞信號轉導通路中都有參與，HBx蛋白的過度表達能夠對細胞轉化起到誘導作用，而且HBx蛋白可以跟抑癌基因p53產生相互作用，讓其失去原有功能［16-17］。索拉菲尼是目前唯一對肝癌有效的分子靶向藥物，臨床上也將索拉菲尼作為晚期肝癌的首選也是唯一治療藥物，但是耐藥性也比較明顯。本研究顯示索拉菲尼對HepG2?HBx細胞的 IC50值為HepG2?3.1細胞的4.65倍，表明HBX上調可導致肝癌細胞對索拉菲尼藥物產生更好的耐藥性，說明在肝癌細胞形成耐藥性時HBX蛋白起到重要作用［18］。經過HIF?1α的介導，HBX基因能夠對多藥耐藥有關基因轉錄起到促進作用，使得化療藥物的非選擇性外排增加，肝癌細胞得到多藥耐藥表型［19］。HBx蛋白也參與了肝癌細胞的耐藥及免疫逃避，也能調節細胞自噬作用。有研究表明HBX基因整合于宿主HepG2細胞基因組后，加快了有害大分子物質的循環，也可能通過改變了宿主細胞的自噬水平，對暴露于化療藥物下的癌細胞起到了保護作用，使得肝癌細胞的耐藥性增強［20］。

現階段，在治療晚期肝細胞癌時主要采用的手段有生物治療、化療等，主要是誘導癌細胞凋亡，從而起到抗腫瘤效果［21］。化療藥物能夠誘導細胞凋亡，敏感性主要是依賴前凋亡與抗凋亡信號的平衡。如今，在治療肝癌時碰到的難題就是耐藥性，在我國，乙肝的發病率相對較高，經過研究證明形成肝癌的一個主要誘因就是HBV［22］。本研究結果顯示索拉菲尼作用24 h后，HepG2?HBx細胞的凋亡率要明顯低于HepG2?3.1細胞的凋亡率（P＜0.05），表明HBX的表達上調能抑制肝癌細胞的凋亡，從而發揮耐藥作用。

若發現耐藥過程當中發揮關鍵作用的信號通路與分子，且正好是對應靶向藥物，那么就可以降低肝癌細胞的耐藥性。HBX蛋白的穩定表達對HepG2細胞的生物學行為產生了影響，HBX蛋白參與并提升了化療藥物外排，使得細胞系增強了耐藥性［23］。基礎研究顯示VEGFA的擴增預示著對索拉菲尼的敏感性增加，Atf2信號通路也影響索拉菲尼藥物敏感性。TβR?Ⅱ/TGF?β通路在調控肝臟炎癥促進肝癌發生過程中起到重要作用，在人類肝癌當中，TGF?β信號通路普遍失活，而且TβR?Ⅱ受體基因表達明顯降低，抑制性Smad7表達升高［23］。基礎研究表明外源性TGF?β能夠對包含完整TGF?β信號通路的細胞增殖進行抑制，TβR?Ⅱ表達沉默后，細胞生長遲緩、凋亡顯著增加［24-25］。植入TβR?Ⅱ基因沉默的肝癌細胞后，體內實驗發現肝癌生長受到抑制［26］。本研究免疫印跡檢測顯示HepG2?HBx細胞較HepG2?3.1細胞的多藥耐藥蛋白TGF?β表達量明顯增高（P＜0.05）。也表明HBX誘導和上調了TβR?Ⅱ的表達，肝癌細胞主動性降低胞內化療藥物濃度的作用增強，導致肝癌細胞產生耐藥性。也有研究表明TβR?Ⅱ在肝癌中滅活有利于腫瘤細胞逃避其抑制細胞增殖的作用，影響肝癌惡性程度、侵襲能力等生物學特性［27-28］。

總之，HBx可通過上調TGF?β/TβR?Ⅱ通路的表達，從而提高索拉菲尼對肝癌細胞的耐藥性，降低細胞凋亡率，HBx是引起肝癌細胞耐藥的重要因素之一。

［1］ HUANG F，CAI P，WANG Y，et al.Up?regulation of brain?expressed X?linked 2 is critical for hepatitis B virus X protein?induced hepatocellular carcinoma development［J］.Oncotarget，2017，8（39）：65789?65799.

［2］ DAI R，PENG F，XIAO X，et al.Hepatitis B virus X protein?induced upregulation of CAT?1 stimulates proliferation and in?hibits apoptosis in hepatocellular carcinoma cells［J］.Oncotar?get，2017，8（37）：60962?60974.

［3］ MAO C S，YIN H，NING H B，et al.Levels of HBx，VEGF，and CEACAM1 in HBV?related hepatocellular carcinoma and their correlation with cancer prognosis［J］.Eur Rev Med Phar?macol Sci，2017，21（17）：3827?3833.

［4］ LV D，WANG Y，ZHANG Y，et al.Downregulated long non?coding RNA DREH promotes cell proliferation in hepatitis B virus?associated hepatocellular carcinoma［J］.Oncol Lett，2017，14（2）：2025?2032.

［5］ HE Z，YU Y，NONG Y，et al.Hepatitis B virus X protein pro?motes hepatocellular carcinoma invasion and metastasis via upregulating thioredoxin interacting protein［J］.Oncol Lett，2017，14（2）：1323?1332.

［6］ YU L，CHEN S，LUO N，et al.The C?terminus domain of the hepatitis B virus x protein stimulates the proliferation of mouse foetal hepatic progenitor cells，although it is not required for the formation of spheroids［J］.Int J Mol Med，2017，40（2）：400?410.

［7］ CHEN S L，LIU L L，LU S X，et al.HBx?mediated decrease of AIM2 contributes to hepatocellular carcinoma metastasis［J］.Mol Oncol，2017，11（9）：1225?1240.

［8］ ZHOU S J，DENG Y L，LIANG H F，et al.Hepatitis B virus X protein promotes CREB?mediated activation of miR?3188 and Notch signaling in hepatocellular carcinoma［J］.Cell Death Dif?fer，2017，24（9）：1577?1587.

［9］ WANG X，OISHI N，SHIMAKAMI T，et al.Hepatitis B virus X protein induces hepatic stem cell?like features in hepatocellu?lar carcinoma by activating KDM5B［J］.World J Gastroenterol，2017，23（18）：3252?3261.

［10］ CHI H C，CHEN S L，LIN S L，et al.Thyroid hormone pro?tects hepatocytes from HBx?induced carcinogenesis by enhanc?ing mitochondrial turnover［J］.Oncogene，2017，36（37）：5274?5284.

［11］ GAO Q，WANG K，CHEN K，et al.HBx protein?mediated ATOH1 downregulation suppresses ARID2 expression and pro?motes hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Sci，2017，108（7）：1328?1337.

［12］ ZHANG J，MA J，WANG H，et al.Serum microRNA?30c lev?els are correlated with disease progression in Xinjiang Uygur patients with chronic hepatitis B［J］.Braz J Med Biol Res，2017，50（6）：e6050.

［13］ HOU Z，XU X，FU X，et al.HBx?related long non?coding RNA MALAT1 promotes cell metastasis via up?regulating LTBP3 in hepatocellular carcinoma［J］.Am J Cancer Res，2017，7（4）：845?856.

［14］ KONG F，YOU H，TANG R，et al.The regulation of proteins associated with the cytoskeleton by hepatitis B virus X protein during hepatocarcinogenesis［J］.Oncol Lett，2017，13（4）：2514?2520.

［15］ CHEN R C，WANG J，KUANG X Y，et al.Integrated analysis of microRNA and mRNA expression profiles in HBx?expressing hepatic cells［J］.World J Gastroenterol，2017，23（10）：1787?1795.

［16］ DENG X，ZHAO X F，LIANG X Q，et al.Linc00152 promotes cancer progression in hepatitis B virus?associated hepatocellular carcinoma［J］.Biomed Pharmacother，2017，7（90）：100?108.

［17］ YOSHIDA M，YAMASHITA T，OKADA H，et al.Sorafenib suppresses extrahepatic metastasis de novo in hepatocellular carcinoma through inhibition of mesenchymal cancer stem cells characterized by the expression of CD90［J］.Sci Rep，2017，7（1）：11292.

［18］ VISHWAKARMA S K，SHARMILA P，BARDIA A，et al.Use of biocompatible sorafenib?gold nanoconjugates for reversal of drug resistance in human hepatoblatoma cells［J］.Sci Rep，2017，7（1）：8539.

［19］ KANG D，HAN Z，OH G H，et al.Down?regulation of TGF?β expression sensitizes the resistance of hepatocellular carcinoma cells to sorafenib［J］.Yonsei Med J，2017，58（5）：899?909.

［20］ ZHAO Z M，LIU H L，SUN X，et al.Levistilide A inhibits angiogenesis in liver fibrosis via vascular endothelial growth factor signaling pathway［J］.Exp Biol Med（Maywood），2017，242（9）：974?985.

［21］ ZHANG X，XU Y，CHEN J M，et al.Huang Qi decoction pre?vents BDL?induced liver fibrosis through inhibition of notch sig?naling activation［J］.Am J Chin Med，2017，45（1）：85?104.

［22］ DEKERVEL J，BULLE A，WINDMOLDERS P，et al.Acrifla?vine inhibits acquired drug resistance by blocking the epithelial?to?mesenchymal transition and the unfolded protein response［J］.Transl Oncol，2017，10（1）：59?69.

［23］ MA W，TAO L，WANG X，et al.Sorafenib inhibits renal fibro?sis induced by unilateral ureteral obstruction via inhibition of macrophage infiltration［J］.Cell Physiol Biochem，2016，39（5）：1837?1849.

［24］ FAN L C，TENG H W，SHIAU C W，et al.Regorafenib（Sti?varga）pharmacologically targets epithelial?mesenchymal transi?tion in colorectal cancer［J］.Oncotarget，2016，7（39）：64136?64147.

［25］ WANG W，QU M，XU L，et al.Sorafenib exerts an anti?keloid activity by antagonizing TGF?β/Smad and MAPK/ERK signaling pathways［J］.J Mol Med（Berl），2016，94（10）：1181?1194.

［26］ SUN H，ZHONG X，WANG C，et al.SNF5 is involved in sup?pression of hepatocellular carcinoma progression via TGF?Beta 1 signaling［J］.Anat Rec（Hoboken），2016，299（7）：869?877.

［27］ BERNARD R，GETACHEW R，KAMATO D，et al.Evalua?tion of the potential synergism of imatinib?related poly kinase in?hibitors using growth factor stimulated proteoglycan synthesis as a model response［J］.J Pharm Pharmacol，2016，68（3）：368?378.

［28］ CHEN W C，CHANG Y S，HSU H P，et al.Therapeutics tar?geting CD90?integrin?AMPK?CD133 signal axis in liver cancer［J］.Oncotarget，2015，6（40）：42923?42937.