Ⅲ型脊髓灰質炎病毒抗原表位嵌合蛋白的免疫學研究

楊筱舟，王晶，夏文躍，潘小霞，趙冰心，滕玉梅，文喻玲，陳元鼎

1.中國醫學科學研究院＆北京協和醫學院 醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，云南 昆明 650118；2.云南民族大學 化學與生物技術學院，民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650118

輪狀病毒（rotavirus，RV）是人和動物腹瀉的主要病原體，為正二十面體顆粒，含3層病毒衣殼，屬于呼腸病毒科（Reovirudae）。RV一種分節段、無包膜的由11個雙鏈RNA片段組成的病毒，可編碼6個結構蛋白（VP）和6個非結構蛋白（NSP）[1]。根據組抗原蛋白VP6的血清型可將現有RV分為A～H共8個組，A、B、C、H組的RV可感染人類[2]。A組RV是引起嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體。根據非糖基化刺突蛋白VP4和糖蛋白VP7編碼基因的同源性差異，可將A組RV進行基因分型，目前共有27個G（VP7）型和37個P型（VP4）[3]。VP6是RV組抗原蛋白，最保守且最豐富，約占病毒結構蛋白總量的39%[4]。

至今尚無治療RV感染的特效藥物，疫苗仍是預防RV感染的最有效方法。作為全球首個口服輪狀病毒疫苗，恒河猴人重組輪狀病毒疫苗于1998年在美國上市，但由于存在腸套疊風險，一年后退出市場。隨后使用最多的是RV減毒活疫苗，如英國產Rotarix疫苗，它是由G1P［8］病毒株所制備的口服減毒活疫苗，兒童接種Rotarix疫苗后抗輪狀病毒IgA抗體陽轉率在新加坡地區可高達93.0%，在印度地區則較低，最高達67.4%[5]。Rotarix對不同型別輪狀病毒的有效性存在差異，比如對G1野生型的平均有效性達64.1%，對非G1型輪狀病毒的平均有效性達59.7%，對P［4］型的平均有效性達70.9%，對P［6］型的平均有效性達55.2%，對P［8］型的平均有效性達59.1%[6]。此外還有美國產的RotaTeq疫苗，它是人牛（WC3）重配株，含5種重配輪狀病毒的口服減毒活疫苗，其中1個表達人RVP［8］型重配株，4個表達人RV（G1-G4型）重配株[7]，美國及芬蘭的兒童在接種RV5疫苗的抗輪狀病毒IgA陽轉率可高達95.5%，在非洲的效率較差，最高可達82.5%[8-9]。美國利用VDS分析方法對RotaTeq進行安全檢測后，發現服用RotaTeq兒童的腸套疊及其他不良反應發生率與正常組比較未見顯著差異[10]。目前，我國自己生產的RV口服疫苗是蘭州生物制品研究所的羅威特疫苗（LLR）。LLR是由羔羊體內血清型為G10P［15］的羊輪狀病毒制備的單價輪狀病毒疫苗，相關研究顯示其平均保護率僅為76%[11]。RV口服減毒活疫苗雖為人們帶來福音，但同時也存在一定的問題，如疫苗安全性問題，可能會發生毒株基因重配，從而引起其他疾病；疫苗污染問題，2010年美國FDA在Rotarix和RotaTeq中發現了豬圓環病毒1型的DNA片段[12]；疫苗保護效果問題，不同地區的保護效果及有效性存在一定的差異，例如Rotarix和RotaTeq在發展中國家的保護性遠低于發達國家。

脊髓灰質炎病毒（poliovirus，PV）屬微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae），腸道病毒屬（Entero?virus）。基因組為正向單鏈RNA，約7.5kb，是由十二個五聚體構成的二十面體病毒顆粒[13]，可編碼VP4、VP2、VP3和 VP1共 4個結構蛋白及 2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D共7個非結構蛋白[14]。根據病毒毒株的不同抗原性，PV被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等3種血清型，血清型之間無交叉免疫反應。人是脊灰病毒惟一的自然宿主，會導致肢體肌肉發生不對稱弛緩性麻痹，也稱小兒麻痹癥[15-16]。

脊灰病毒引起的脊髓灰質炎目前只能通過疫苗進行預防[17]，如口服脊灰減毒活疫苗OPV和滅活疫苗IPV。但隨著OPV的使用，疫苗相關麻痹性脊髓灰質炎（vaccine-associated paralytic po?liomyelitis，VAPP）和疫苗衍生脊髓灰質炎病毒（vaccine-derived poliovirus，VDPV）問題隨之出現。VAPP會使因個體差異或具有免疫功能缺陷的接種者在接種過程中產生麻痹型脊灰問題，而VDPV會使已消除脊灰病毒的國家因為繼續使用OPV而產生疫苗衍生脊灰病毒[18]，進而會產生循環，形成 cVDPV（circulating vaccine-derived polio?viruses）[19]。IPV一般采用注射形式接種，且不存在上述OPV所引起的疫苗衍生病例，目前較為推廣的是利用Sabin株病毒生產的IPV。

綜上所述，由于現有的RV和PV疫苗都存在一定的弊端，因此研發新的疫苗是當今趨勢。在此，我們通過分子克隆技術構建了包含RVVP6和PV3抗原表位1的載體質粒，在大腸桿菌中表達嵌合蛋白，為新型RV、PV疫苗和疫苗載體研究提供了新的方向，并有助于其開發利用。

1 材料和方法

1.1 材料

用于基因克隆和擴增的大腸桿菌DH5α以及用于蛋白表達的大腸桿菌BL21（DE3）由本實驗室提供；RVSA11株和PVⅢ型457PfizerRS1（PV3）來自世界衛生組織（WHO）；表達質粒pETL由本實驗室自pET-3a改造而來；豚鼠抗載體蛋白VP6F血清抗體、抗輪狀病毒Wa株血清抗體和抗PV3血清抗體由本實驗室制備；限制性內切酶、250bpDNA分子量標準和T4DNA連接酶等購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗豚鼠IgG（含輕鏈和重鏈）購自KPL公司；二氨基聯苯胺（DAB）購自Sigma公司。

1.2 pETP6F載體蛋白質粒的構建

克隆重組人RVTB-Chen株VP6的cDNA，在編碼VP6蛋白結構表面位置插入6個內切酶位點（SacⅠ、BspT104、KpnⅠ、BlnⅠ、SacⅡ和XhoⅠ），得到含6個插入位點I1、I2、I3、I4、I5、I6的重組載體蛋白VP6F（380氨基酸殘基，相對分子質量為43200）的編碼DNA。將重組載體蛋白VP6F編碼DNA插入空載體質粒pETL的NdeⅠ/BamHⅠ克隆位點，構建攜帶載體蛋白VP6F編碼DNA的重組表達質粒pETP6F。

Aim: The aim of the study was to perform a comparative evaluation of the use of various methods of reconstructive assistance in the repair of the femoral-tibial segment in patients with peripheral arterial disease.

1.3 重組抗原表位

選取PV3中和位點1（NAg1）的氨基酸序列作為外源抗原表位（命名為PV3N1），其基因序列為GAGGTGGACAATGAACAAACCACCCGGGCACAGA AG，對應的氨基酸序列為EVDNEQPTTRAQK。人工合成編碼抗原表位PV3N1的互補核苷酸引物，兩端引入XhoⅠ酶切位點，上游引物為PV3/N1-308X-F：TCGAGGTGGACAATGAACAACCAACCA CCCGGGCACAGAAGC，下游引物為PV3/N1-308XR：TCGAGCTTCTGTGCCCGGGTGGTTGGTTGTTCA TTGTCCACC。將設計合成的互補引物片段進行退火，制備插入片段，并在T4DNA連接酶的作用下，插入VP6F載體蛋白上的I6位點。

1.4 嵌合蛋白表達質粒的構建

將抗原表位嵌合蛋白編碼基因重組連接到pETL質粒的NdeⅠ/BamHⅠ克隆位點上，構建在VP6F上攜帶PV3抗原表位基因的重組嵌合表達質粒pETP6F/PV3N1。經雙酶切反應鑒定該重組嵌合表達質粒連接成功，通過DNA測序確定目的基因正確完整。

1.5 重組嵌合蛋白的表達

將重組質粒pETP6F、pETP6F308X/PV3V1分別轉化大腸桿菌DH5α進行表達，并利用堿裂解法提取大腸桿菌DH5α中的質粒DNA，經酶切鑒定及DNA測序確定。再將重組質粒pETP6F、pETP6F308X/PV3V1分別轉化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB培養基上于37℃表達。

1.6 重組嵌合蛋白的SDS-PAGE檢測及純化

重組質粒轉化細胞培養液于4℃、4000r/min離心8min，菌體沉淀用超聲波裂解緩沖液［200mmol/LNaCl，50mmol/LTris（pH7.5），5%甘油，5%Triton X-100，2mmol/LEDTA（pH8.0），0.2% β巰基乙醇］懸浮，于冰水浴中超聲波裂解30min，功率30%，裂解液經4℃、12000r/min離心30min，沉淀（包涵體）蛋白溶于8mol/L尿素，分裝，保存待檢。

溶解于8mol/L尿素中的包涵體蛋白通過10%SDS-PAGE檢測及分離純化（電壓130V，電流150mA，功率90W）。約電泳6h，溴酚藍跑到膠面的最下端，取下凝膠，放入150mmol/L KCl中顯色，當凝膠上出現明顯條帶時切下重組蛋白目的條帶，放入12%SDS-PAGE的凝膠柱中電泳（20mA，4℃，15h），富集到與凝膠柱相連的盛有不含SDS的電泳液的回收杯中，收集蛋白回收液，加入疊氮化鈉，分裝，-20℃保存。

1.7 Western印跡

用載體蛋白和PV免疫動物血清抗體對重組蛋白進行Western印跡檢測。用半干轉印法將SDS-PAGE分離的凝膠上的嵌合蛋白轉移至PVDF膜上（恒壓15V，時間30min），用5%脫脂奶粉（TBS稀釋）于4℃封閉過夜，加入抗VP6F或抗PV豚鼠免疫血清抗體（一抗，1∶500稀釋），37℃孵育 1.5h，TBS-T（加入 0.05%Tween-20的TBS）漂洗5次，每次5min，加入HRP標記的羊抗豚鼠 IgG（二抗，1∶2000稀釋），37℃孵育 1h；TBS-T漂洗5次，每次5min，將膜放入DAB溶液（10mg/mL，TBS稀釋，使用前加入30%過氧化氫溶液）顯色，蒸餾水漂洗終止顯色，拍照。

2 結果

2.1 重組嵌合蛋白表達載體質粒的構建

用分子克隆手段構建載體蛋白VP6F表達質粒pETP6F及嵌合蛋白表達質粒pETP6F/PV3N1，經BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，分別在相應位置可見約370和410bp的條帶（圖1），與預期相符，表明嵌合蛋白基因中成功插入PV3NAg1處的抗原表位基因。經DNA測序，確認所構建的質粒核苷酸序列完整正確。

2.2 重組嵌合蛋白在大腸桿菌BL21（DE3）中的表達和純化

重組表達的載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1經SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍染色后觀察其蛋白相對分子質量，結果如圖2。

2.3 Western印跡

載體蛋白VP6F免疫的豚鼠血清抗體能特異性結合載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3A）；輪狀病毒Wa株免疫的豚鼠血清抗體能特異性結合載體蛋白VP6F和嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3B）；PV3免疫的豚鼠血清抗體只能特異性結合嵌合蛋白6F/PV3N1（圖3C）；PV1免疫的豚鼠血清抗體無法特異性結合嵌合蛋白6F/PV3N1和載體蛋白VP6F（無條帶，圖未示）。

3 討論

嵌合基因是指通過基因重組技術將來源不同的DNA序列重組而成的人造基因，將其通過載體轉入宿主細胞表達產生的融合蛋白稱為嵌合蛋白。在構建嵌合蛋白的過程中，我們首先選擇A組人RVTB-Chen株的組抗原蛋白VP6的編碼基因進行克隆，因為VP6蛋白是RV中含量最高、保守性最強的蛋白，在哺乳動物中其同源性可高達87%～99%[20]，所以用它制備疫苗會產生較強的免疫原性。將VP6與空載體pETL重組后構建載體蛋白VP6F，再將PV3抗原表位NAg1插入載體蛋白VP6F，構建嵌合蛋白載體pET6F/PV3N1，將該載體轉化大腸桿菌進行大量表達，獲得嵌合蛋白6F/PV3N1。通過Western印跡可觀察到6F/PV3N1可以與豚鼠抗載體蛋白VP6F血清抗體、抗輪狀病毒Wa株血清抗體和抗PV3血清抗體產生特異性結合，但不能與抗PV1血清抗體產生反應，證明了6F/PV3N1的免疫原性和特異性，以及PV不同血清型間不產生交叉反應。該實驗為RV和PV疫苗的發展提供了一定的基礎。

圖1 重組質粒BlnⅠ/BamHⅠ雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳M：250bpDNAmarker；1：pETP6F；2：pETP6F/PV3N1

圖2 載體蛋白和重組嵌合蛋白的SDS-PAGE

圖3 VP6F（A）、輪狀病毒Wa株（B）、PV（C）免疫豚鼠血清抗體的Western印跡