解密圓環疫苗新時代風向標一一圓柯欣

周盼伊

豬圓環病毒（Porcinecircoviruses，PCV）是單股環狀的DNA病毒，基因組長度約為1.7kb長，是最小的動物病毒之一。已經確定有兩種類型的PCV，即圓環病毒1型（PCVl）和圓環病毒2型（PCV2）。

PCV1對豬只沒有致病性，PCV2于1998年首次報道，其在臨床條件下能引起豬只的豬圓環病毒相關疾病（Porcinecircovirus associated diseases，PCVAD），主要引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、肺炎、豬皮炎和腎病綜合征和繁殖障礙，主要表現為呼吸、泌尿、腸道、淋巴、心血管、神經、繁殖系統以及皮膚的功能紊亂，對全世界的生豬養殖造成了重大的經濟損失。

調查數據表明：目前各規模豬場圓環病毒相關疾病（ PCVAD）的平均經濟損失，最低為34.33元，還不包括圓環病毒疫病爆發導致的損失。（數據來源：規模豬場圓環病毒相關病（ PCVAD）經濟損失評估報告，第四次豬病學研討會會議論文集）。

協同感染是PCV2致病性的主要起因，副豬嗜血桿菌、PRRSV和豬支原體肺炎在實驗和田間條件下都會加劇與PCV2相關的損傷，增加PCVAD的發生率。

疫苗在豬圓環病毒病的防控起到非常重要的作用，2010年，普萊柯上市了國內首個豬圓環病毒疫苗。目前，有33家圓環疫苗生產廠家取得了批準文號，10種疫苗類型中，以不同毒株的全病毒圓環滅活疫苗為主，而基因工程疫苗則是疫苗企業爭相研發的風向標，除了2017年11月隆重上市的“圓柯欣”外，9家企業正在開發9種不同的圓環基因工程苗。

為什么研發重點由全病毒圓環滅活疫苗轉為基因工程亞單位疫苗了呢？全病毒滅活疫苗，因圓環病毒培養難度高、不同批次間病毒培養滴度差異明顯、抗原滅活過程會損害抗原的免疫原性以及抗原未進行純化等原因，一般需進行二次免疫才能達到理想效果且會存在一定的免疫副反應。基因工程亞單位疫苗只包含Cap蛋白，不僅免疫原針對性強，而且抗原含量高、純度高，免疫劑量和次數都有減少，因此越來越受到養殖戶青睞。

國內首個純病毒樣顆粒豬圓環病毒2型基因工程亞單位疫苗（大腸桿菌源）——“圓柯欣”又有怎樣的新特點呢？豬圓環病毒病毒樣顆粒疫苗是通過把豬圓環病毒的主要抗原基因導入到表達載體中進行高效表達，然后把表達的免疫原性蛋白（CAP蛋白）組裝成病毒樣顆粒而制成的基因工程亞單位疫苗。與傳統豬圓環病毒滅活疫苗相比，豬圓環病毒病毒樣顆粒疫苗具有不可比擬的優點。

“圓柯欣”上市發布會后，業內國內外多位豬病防控專家對其進行了熱烈討論。

焦點一：病毒樣顆粒應用于圓環疫苗有何優勢？

病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLPs）是由病毒單一或多個結構蛋白自行裝配而成的高度結構化的蛋白質顆粒，保持了病毒抗原蛋白的天然構象，因而具備激發宿主先天和適應性免疫反應功能。在形態上，VLPs類似未成熟的病毒粒子，但是由于缺乏調節蛋白和感染性核酸，無復制和感染能力。在過去的三十年中，病毒樣顆粒技術應用逐漸廣泛，尤其在疫苗領域。

區別于昆蟲細胞/}干狀病毒系統的VLPs體內組裝，VLPs的體外組裝可以很好的避免細胞內其它蛋白、核酸的干擾，組裝出更均一的VLPs。

病毒樣顆粒具有安全性更高、免疫原性更強、副反應更小、操作更方便等諸多優勢。豬圓環病毒病毒樣顆粒疫苗選用的是豬圓環病毒的一段主要抗原基因制備而成，沒有選用全病毒，這樣就避免了全病毒滅活疫苗在病毒培養過程中造成的異源病原污染風險和由于病毒滅活不徹底而造成散毒的風險。疫苗中的有效抗原是組裝成病毒樣顆粒的CAP蛋白，其病毒樣顆粒與天然豬圓環病毒的空間構象及其相似，可以通過和天然病毒感染機體一樣的途徑遞程免疫細胞，誘導全面的體液免疫和細胞免疫反應，免疫原性明顯優于傳統滅活疫苗。在制備過程中采用在原核表達系統中表達的CAP蛋白制備抗原，沒有培養全病毒、這樣就有效解決了豬圓環病毒滅活疫苗在培養病毒過程中血清蛋白、細胞碎片和在滅活過程中滅活劑等成分造成的免疫副反應過大的困擾。該疫苗仔豬只需免疫1次，每次只需免疫1毫升，而傳統豬圓環病毒滅活疫苗仔豬需要免疫2次，每次需要免疫2ml。不但降低了免疫次數，而且減少了免疫劑量，即方便操作，也有效降低了免疫注射給豬群造成的應激反應。

焦點二：為何采用大腸桿菌表達系統？

大腸桿菌表達系統是通過DNA重組技術，在大腸桿菌中高效表達編碼病原微生物保護性抗原基因的一個表達系統。是目前重組蛋白表達的最常用系統，大腸桿菌表達系統研究的較早，具有背景清楚，操作簡便，表達量高等諸多優點。表達水平相對于哺乳動物表達系統來說明顯更高，但也有相對應的缺點，如大腸桿菌系統不能將表達蛋白分泌到胞外，二硫鍵的形成能力有限，不能實現蛋白表達復雜修飾（如糖基化修飾等）。

昆蟲桿狀病毒表達載體系統是利用攜帶有外源目的基因的重組昆蟲桿狀病毒作載體在昆蟲體內或昆蟲培養細胞進行表達生產的一個重組蛋白生產系統。由于該系統所需要的周期遠比動物或植物系統短，可以利用昆蟲個體或其培養細胞進行大規模的表達生產，生產的重組蛋白產量高，蛋白翻譯后加工比細菌、酵母生產系統完善，而且由于昆蟲桿狀病毒具有限制性的宿主范圍，只對特定種屬的昆蟲及其細胞進行感染，對人畜等脊椎動物沒有感染能力，因此具有比在哺乳動物及其培養細胞生產系統更為安全等優點而成為目前最有效的真核表達系統之一。（表1）

豬圓環病毒2型疫苗可以采用大腸桿菌表達系統的原因是：豬圓環病毒2型全基因長為1766-1768 bp，為目前已知感染豬群的最小的病毒之一。圓環病毒表面只存在一種結構蛋白（cap蛋白），該蛋白不需要任何糖基化位點修飾，因此采用大腸桿菌表達系統和采用桿狀病毒表達系統從根本而言沒有任何差別。此外，大腸桿菌表達系統具有操作簡便、周期短，成本低等優點，所以在圓環病毒2型Cap蛋白表達時選擇大腸桿菌表達系統更具有競爭力。

焦點三：“圓柯欣”有哪些技術突破？

普萊柯生物自2010年上市國內首個全病毒豬圓環病毒2型滅活疫苗（SH株）之后，長期致力于更高品質圓環系列產品的研究與開發，新上市的豬圓環病毒2型基因工程亞單位疫苗“圓柯欣”主要突破在于：突破了可溶性蛋白的表達、高純度Cap蛋白提取、病毒樣顆粒組裝3項核心技術。

1）可溶性蛋白的表達

大腸桿菌表達系統因其自身眾多的優點而成為表達外源性蛋白的首選，但是外源蛋白在大腸桿菌表達過程中往往不能正確折疊而形成不溶的無活性蛋白，即包涵體。如何提Cap蛋白的可溶性表達，專家們進行了深入的研究。在豐富的大腸桿菌表達技術儲備和完善的載體庫與基因庫基礎上，通過生物信息學統計分析和基因重組克隆技術構建、優化和篩選表達載體，實現該技術的突破，使得可溶性Cap蛋白在大腸桿菌中的表達量有了質的提升。

2）高純度Cap蛋白獲取

Cap蛋白經過表達、粗純后，其中仍含有大量大腸桿菌的蛋白、核酸、細胞碎片等雜質，這些雜質會影響病毒樣顆粒的形成，導致產生不完整和不規整的顆粒，同時也會影響疫苗的免疫效力。獲取高純度的蛋白是做好疫苗的首要難點之一。

國家獸用藥品工程技術研究中心多位專家經過長期研究，通過多重蛋白層析純化，獲得了高純度的Cap蛋白，將Cap蛋白的純度提高至95%以上，從而為后續高效的組裝完整的病毒樣顆粒奠定了基礎。（圖1，2）

3）病毒樣顆粒組裝

獲得了最基本的原料，如何將Cap蛋白組裝成有效的病毒樣粒子是核心技術。在以前的研究中，該難點是很多學者難以逾越的技術屏障。因為組裝條件不成熟，疫苗中Cap蛋白主要以單體或多聚體的形式存在或者部分組裝后的顆粒與PCV2病毒本身的大小、結構存在差異，即使含量再高，也無法產生很高的抗體，對豬只無法進行高效的保護。

國家獸用藥品工程技術研究中心聯合新加坡國立大學經過長期的技術攻關，通過切向流超濾等技術在特定的緩沖液中實現組裝。動態光散射分析顯示將近100%的蛋白都組裝成病毒樣顆粒。通過投射電鏡，我們可以看到組裝成VLPs的真實面目：均一、完整的20nm左右的顆粒。（圖3）

國內首個純病毒樣顆粒豬圓環病毒2型基因工程亞單位疫苗（大腸桿菌源）一一“圓柯欣”的上市，將會加速推動豬用疫苗產業進入基因工程時代，在進一步強化普萊柯在豬苗市場競爭優勢的同時，引領我國動物疫苗產業技術進步，為我國家畜疫病防控及安全畜產品生產提供強有力的技術和產品支撐。