外周血淋巴細胞亞群檢測對兒童亞急性壞死性淋巴結炎的診療意義

朱林超， 張書峰， 王旭輝， 王霖， 王曉暉， 孫英

兒童亞急性壞死性淋巴結炎(children subacute necrotizing lymphadenitis，CSNL)，又叫組織細胞壞死性淋巴結炎或Kikuchi-Fujimoto病，是一種炎性免疫反應性淋巴結腫大性疾病，臨床表現為發熱、淋巴結腫大、白細胞下降等，病因及發病機制不明確，病情進展快，臨床表現多樣，既往診斷缺乏特異指標，易和頸部淋巴瘤等混淆，極易誤診誤治，有報道誤診率高達45%～85%。該病一年四季皆可發病，往往繼發于患兒病毒感染或咽峽炎后，近年來，國內外發病率明顯增高，給臨床醫生、患兒家庭造成極大負擔。本研究旨在采用流式細胞技術檢測CSNL患兒及健康兒童外周血T淋巴細胞亞群百分率，探討外周血T淋巴細胞亞群檢測對CSNL的診療意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至2016年12月河南省人民醫院小兒外科及內科收治的CSNL患兒51例，其中男28例，女23例；年齡3個月至9歲，平均年齡(5.2±2.5)歲。同期選擇門診健康體檢兒童30例為對照組，其中男17例，女13例；年齡2個月至9歲，平均年齡(6.3±2.7)歲。兩組兒童在性別、年齡方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 (1)臨床標準：①發熱，并有上呼吸道感染等前驅癥狀，多為中高熱，發熱時間長，熱型多呈弛張熱，應用抗菌藥物治療無效；②淋巴結腫大，可有頸、腋及鎖骨上窩淋巴結等部位的輕度痛性腫大，部分患兒可有一過性肝脾腫大及皮疹。(2)實驗室標準:①均行淋巴結活檢，鏡下見淋巴結正常結構消失，副皮質附近有大片壞死，壞死區周圍有大量組織細胞而無粒細胞浸潤，并可見變異淋巴細胞(即免疫母細胞)和漿細胞樣單核細胞同時出現；②血常規檢查示白細胞總數或中性粒細胞數降低，C反應蛋白正常；③血生化檢查：乳酸脫氫酶、血沉升高，肌酸激酶正常[1]。

1.3 納入標準 (1)符合CSNL的診斷標準；(2)年齡2個月至9歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4 排除標準 (1)白細胞總數或中性粒細胞百分比明顯增高，考慮細菌感染者；(2)有淋巴結腫大而未行淋巴結活檢者。

1.5 治療方法 所有CSNL患兒予激素治療，輕癥者口服潑尼松片1.5～3.0 mg/(kg·d)，每日2次，癥狀減輕后3～5 d，逐漸減至0.5 mg/(kg·d)，每日2次，直至治愈；重癥或無法口服患兒給予甲潑尼龍針靜脈滴注，1.5～4.5 mg/(kg·d)，每日1次，穩定后改為潑尼松片口服；局部予50%硫酸鎂溶液溫熱敷，每日3～5次，治療12～48 h后體溫降至正常判定療效。

1.6 檢測方法 采集外周靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸二鉀抗凝。采用流式細胞技術檢測T淋巴細胞亞群。取100 μL上述外周血(抗凝)分別加入4個試管中，每管加入抗CD4-多甲藻黃素-葉綠素蛋白(PerCP)10 μL。各管再依次加入抗CD3-異硫氰酸熒光素(FITC)+CD19-藻紅蛋白(PE)、抗CD3-FITC+CD8-PE、抗CD3-FITC+CD4-PE、抗CD3-FITC各10 μL，避光室溫充分結合20 min后，每管加入溶血素2 mL，避光放置至透明后2 500×g離心5 min，棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖液2 mL，在混合器上使試管底部的細胞與磷酸鹽緩沖液混勻，2 500×g離心5 min，最后加入磷酸鹽緩沖液0.4 mL混勻，用美國BECKMAN COULTER公司CYTOMICS EC 500流式細胞儀檢測。

1.7 觀察指標 (1)治療效果；(2)治療前兩組患兒淋巴細胞亞群百分率；(3)治愈和好轉患兒治療前、中、后淋巴細胞亞群細胞百分率變化(注：治療中為開始治療至治療結束中的統一時間)。

1.8 療效判定標準 (1)治愈：全身及局部癥狀消退，血WBC正常；(2)好轉：全身癥狀消退，局部癥狀未全消；(3)無效：全身及局部癥狀均無改善或加重[1-2]。

2 結果

2.1 治療效果 51例CSNL患兒中，治愈38例，好轉12例，無效1例。

2.2 治療前兩組外周血淋巴細胞亞群百分率的比較 治療前CSNL患兒CD3+、CD4+、CD19+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+均顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 治療前兩組外周血淋巴細胞亞群百分率比較

注：與對照組比較，at=-5.004，-6.116，-6.006，-5.171，P<0.05。

2.2 治愈和好轉患兒治療前、中、后淋巴細胞亞群細胞百分率變化 見表2。

表2 治愈與好轉患兒治療前中后外周血T淋巴細胞亞群百分率比較

注：與治療前比較，aP<0.05。

表2結果表明，38例治愈患兒治療中、后外周血CD3+、CD4+、CD19+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+顯著高于治療前，治療后的指標又顯著高于治療中，差異有統計學意義(P<0.05)；12例好轉患兒治療中、后外周血CD3+、CD4+、CD19+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+顯著高于治療前，治療后的指標又高于治療中，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 治愈與好轉患兒治療后與對照組外周血T淋巴細胞亞群百分率比較 治愈與好轉患兒治療后與對照組比較，CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

3 討論

國外學者較早提出成人亞急性壞死性淋巴結炎是一種自限性疾病[3]，發病率不高，故CSNL早期往往被大家忽視。近年來，國內外大宗報道，CSNL發病率明顯上升，因其病情進展快，又往往被誤診誤治，給患兒健康及社會造成極大危害[4]。

表3 治愈與好轉患兒治療后與對照組外周血T淋巴細胞亞群百分率比較

關于CSNL的發病機制學說很多，目前認為感染(病毒、細菌、原蟲等)、腫瘤、理化因素等可刺激一些特殊的免疫應答而導致本病，國內外提出較多的是病毒感染，如EB病毒、流感病毒、人類皰疹病毒、巨細胞病毒等，受累淋巴結的壞死被認為是由病毒引起的細胞凋亡所致，Stephan等[5]報道患兒在感染人類皰疹病毒、EB病毒后繼發CSNL。

本研究51例CSNL患兒均有發熱、淋巴結腫大、激素治療有效，30例有血沉升高，18例有皮疹等癥狀，均與變態反應有關，故本研究認為CSNL是由于感染使機體的免疫平衡受到破壞而發生自身免疫性疾病或變態反應性疾病樣改變。CSNL臨床特點總結如下：(1)發熱，絕大多數患兒有發熱，發熱時間長，熱型多呈弛張熱，且為中高熱，多數發熱超過39 ℃，并有上呼吸道感染等前驅癥狀，應用抗菌藥物治療無效；(2)淋巴結腫大，全身淺表淋巴結均可發生，以頸部及鎖骨上窩淋巴結腫大為著，伴或不伴疼痛，多數活動度良好，部分出現粘連、融合、成團；(3)實驗室檢查：外周血淋巴細胞異常，白細胞總數減少，血沉升高，C反應蛋白正常或升高，乳酸脫氫酶、羥丁酸脫氫酶升高，且乳酸脫氫酶升高程度與病情嚴重度有關[6]；(4)部分患兒可有一過性肝脾腫大及皮疹，可有肝功能異常；(5)激素治療及手術切取受累淋巴結有效。

對于CSNL的治療，激素敏感，起效快，輕癥者口服潑尼松片1.5～3.0 mg/(kg·d)，每日2次，癥狀減輕后3～5 d，逐漸減至0.5 mg/(kg·d)，每日2次，直至治愈；重癥或無法口服患兒給予甲潑尼龍針靜脈滴注，1.5～4.5 mg/(kg·d)，每日1次。任兵等[7]提出可結合中醫治療，以疏風清熱為治則，方以五味消毒飲加減，同時輔以青黃膏貼患處；亦可借鑒呂延偉教授治療兒童頸部急性淋巴結炎的學術思想，效果理想[8]。

CSNL發病率漸高，臨床表現多樣，缺乏特異性，病理組織形態復雜，導致誤診、誤治率較高，往往繼發其他免疫系統疾病，如系統性紅斑狼瘡、隱源性機化性肺炎、自身免疫性肝炎等，嚴重的引起死亡[9]。因此，找到一種較特異性的檢測指標，有助于CSNL的診療顯得尤為重要。

T淋巴細胞，是由胸腺內的淋巴干細胞分化而成，是機體免疫系統功能中最重要的細胞群，是反映機體免疫狀態的重要指標。按其功能常分為3個亞群：輔助性T細胞(helper T cells,Th)、抑制性T細胞(suppressor T cells,Ts)和細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells,Tc)。Th細胞，具有協助體液免疫和細胞免疫的功能；Ts細胞，具有抑制細胞免疫及體液免疫的功能；Tc細胞，具有殺傷靶細胞的功能，它們的正常功能對人類抵御疾病非常重要。當T淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常或變化時，會導致機體免疫系統紊亂并產生病理變化，尤其是T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+細胞數量和相對比值的變化在免疫系統中占主導地位[10]。

其中CD3+細胞反映了T淋巴細胞活化的比例，Th細胞即為CD4+細胞，其在表面表達CD4，通過與主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ)遞呈的多肽抗原反應被激活。MHCⅡ在抗原遞呈細胞表面表達。CD4+細胞一旦激活，可以分泌細胞因子，調節或者協助免疫反應。CD8+分子表達在Ts細胞及Tc細胞表面，亞群CD8+細胞多反映Ts細胞功能，這類細胞可以通過MHCⅠ與抗原直接結合。CD3+、CD4+和CD8+細胞的數量保持在一定的比例，維持機體的細胞免疫功能平衡。本研究資料記錄分析了51例CSNL患兒的T淋巴細胞亞群，發現初診患兒CD3+、CD4+細胞以及CD4+/CD8+比值與對照組對比顯著降低，這與國內一些報道相一致[11]。

CD3+的降低說明了T淋巴細胞總數的減少導致了CSNL患兒T淋巴細胞的異常，免疫應答使機體免疫系統處于失衡狀態，特別是CD4+的明顯減少，提示作為Th細胞減少可能導致機體免疫系統的過度激活，引起細胞免疫的紊亂。另一方面，Th和Ts細胞比例在機體正常情況下維持一個相對平衡狀態，一旦這個平衡打破，機體免疫系統也會出現紊亂[12]。

本研究顯示，治療前51例CSNL患兒與對照組患兒外周血CD3+、CD4+、CD19+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+均顯著低于對照組。經治療，治療中及治療后均動態監測CSNL患兒外周血T淋巴細胞亞群，發現38例治愈患兒治療中、后外周血CD3+、CD4+、CD19+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+顯著高于治療前，治療后的指標又高于治療中；治療后與對照組比較，CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+差異無統計學意義；12例好轉患兒治療中、后外周血CD3+、CD19+、CD4+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+顯著高于治療前，治療后的指標又高于治療中；治療后與對照組比較，CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+差異無統計學意義。本研究兩組中，CSNL治療后與對照組比較，CD4+/CD8+差異無統計學意義，說明Th細胞相對Ts細胞增加，CD4+細胞受抗原刺激后，產生大量細胞因子，促進CD8+細胞的活性，這與有些學者觀點一致[13]。CD8+細胞能分泌抑制因子，減弱或抑制免疫應答，對CD4+細胞有調節性抑制作用。與國外學者報道一致，體現出CD4+/CD8+比例平衡是維持免疫內環境穩定和調控機體免疫網絡的重要樞紐，反映了機體免疫反應的調節能力[14]。

B細胞的激活依賴于Th細胞和Ts細胞的調節，治療后CD19+的明顯增高可能與Th的減少伴有Ts的增加有關，從而造成B細胞抑制降低，活化增加，導致B淋巴細胞功能亢進，并產生大量抗體，使得患兒的體液免疫發生紊亂[15]。此外，治療中與治療后指標比較發現，CD3+、CD4+、CD19+淋巴細胞亞群百分率和CD4+/CD8+明顯高于治療前，治療后的指標又高于治療中，但CD3+、CD8+升幅高于CD4+/CD8+、CD19+及CD4+，說明細胞免疫和體液免疫的紊亂無論在T淋巴細胞總數、B淋巴細胞的總數，還是Th/Ts細胞的比例，在恢復期都處于一個逐漸修復平衡的狀態，這對病程的判斷和治療有重要意義。

綜上所述，動態檢測淋巴細胞亞群對評估CSNL患兒的免疫狀況、診斷、病理進程、療效和預后分析有重要幫助，細胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及CD19+，可作為臨床CSNL診療的重要評估指標。

[1] 孫錕，沈潁.小兒內科學[M].北京：人民衛生出版社，2014：376-377．

[2] 盛紅玲，張秋業.小兒亞急性壞死性淋巴結炎45例臨床分析[J].中國醫藥科學，2012，2(2):14-16．

[3] Bosch X, Guilabert A. Kikuchi-Fujimoto disease[J]. Orphanet J Rare Dis，2006，1:18.

[4] Bi L, Li J, Lu Z,et al.Recurrence of histiocytic necrotizing lymphadenitis: A case report and literature review[J]. Exp Ther Med，2014，7(5):1167-1169.

[5] Stéphan JL, Jeannoel P, Chanoz J，et al. Epstein-Barr virus-associated Kikuchi disease in two children[J]. J Pediatr Hematol Oncol，2001，23(4):240-243.

[6] Kikuchi M, Ohshima K. Cervical lymphadenopathy，fever and leukopenia[J].Pathol Case Review，2012,9:1992-2005.

[7] 任兵，任獻青.中醫治療急性頸部淋巴結炎體會[J].中國中西醫結合兒科學，2014，6(6):515-516．

[8] 李鑫，呂延偉.呂延偉教授治療兒童急性頸淋巴結炎經驗[J].中國中西醫結合兒科學，2013，5(4):314-315．

[9] Tselios K, Sarantopoulos A, Gkougkourelas I, et al.CD4+CD25 high FOXP3+T regulatory cells as a biomarker of disease activity in systemic lupuserythematosus: a prospective study[J]. Clin Exp Rheumatol，2014，32(5):630-639.

[10]Liu H, Ouyang X, Li Y, et al.Involvement of levels of Toll like receptor-4 in monocytes, CD4+T-lymphocyte subsets, and cytokines in patients with immune thrombocytopenic purpura[J]. Thromb Res，2013，132(2):196-201.

[11]杜華，師永紅，師迎旭.組織細胞壞死性淋巴結炎84例的臨床病理和免疫表型特點[J].中華病理學雜志，2016，45(2): 86-90．

[12]陳少艷，劉基鐸，肖明鋒，等.淋巴細胞亞群檢測在感染性疾病中的應用[J].國際檢驗醫學雜志，2017，38(2):206-208．

[13]Jucaud V, Ravindranath MH, Terasaki PI, et al.Serum antibodies to human leucocyte antigen (HLA)-E, HLA-F and HLA-G in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) during disease flares: Clinical relevance of HLA-Fautoantibodies[J]. Clin Exp Immunol，2016，183(3):326-340.

[14]李文良，高亮.CD4+T細胞及淋巴細胞亞群在小兒哮喘與肺炎中的水平及臨床意義[J].中國婦幼健康研究，2016，27(7): 861-863．

[15]Goodridge JP, Lee N, Burian A, et al.HLA-F and MHC-I open conformers cooperate in a MHC-I antigen cross-presentation pathway[J]. J Immunol，2013，191(4):1567-1577.