無添加釀造醬油的低聚肽特征性分析

陳建國,梁寒峭*,王憬,劉偉,程池,榮長遠

1(中國食品發酵工業研究院，中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京， 100015) 2(聊城正信生態農業科技園有限公司，山東 聊城，252000)

醬油含有豐富的風味物質、礦物質、維生素等營養成分，以及生理活性物質，如大豆多肽、大豆異黃酮、大豆皂苷、有機酸等，具有促進消化、增強食欲、消炎、降血壓、抗氧化等多種功能[1-3]。釀造醬油是指以大豆或脫脂大豆、小麥和(或)麩皮為原料，經微生物發酵制成的具有特殊色、香、味的液體調味品[4]。無添加釀造醬油是指大豆、小麥等原料經微生物發酵結束后，不再使用任何食品配料、食品添加劑，制備而成的釀造醬油。無添加釀造醬油(無添加醬油)配料表中只標注含有大豆或脫脂大豆、小麥和(或)麩皮、食鹽等原料，不含有白砂糖、酵母提取物等食品配料，以及甜味劑(三氯蔗糖、安賽蜜等)、增鮮劑(谷氨酸鈉、5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉等)、防腐劑(苯甲酸鈉、山梨酸鉀等)、焦糖色素等。

醬油低聚肽主要為大豆低聚肽，指在醬油生產過程中，大豆蛋白質經酶解產生游離氨基酸的同時，還保留了大量中間產物——小肽分子。大豆低聚肽不僅具有良好的水解性、穩定性和易吸收等特點，而且具有調節腸道、增強免疫力、降血脂、降血壓、抗疲勞等功能[6-10]。目前關于醬油中的游離氨基酸、氨基酸態氮、有機酸、風味物質等研究較多[11-13]，但對醬油中低聚肽特征性的研究鮮見報道。本研究首次分析了釀造醬油低聚肽含量、分子質量分布及其氨基酸組成，為科學評價釀造醬油的營養及品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

1號醬油樣品(無添加釀造醬油，特級醬油)，聊城正信生態農業科技園有限公司提供；2號醬油樣品(釀造醬油，特級醬油)和3號醬油樣品(釀造醬油，三級醬油)，均購于北京家樂福超市；其他化學試劑均為分析純。

表1 醬油產品信息Table 1 Information on soy sauce products

1.2 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；A300型氨基酸分析儀，德國 Membrapure公司；3K-15型冷凍離心機，德國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低聚肽含量測定[14-15]

醬油樣品經三氯乙酸溶液溶解后，離心分離出沉淀蛋白質，收集離心清液。分別測定離心清液的酸溶蛋白質水解物含量和游離氨基酸含量，按照公式(1)計算醬油低聚肽含量：

m=m1-m2

(1)

式中：m，低聚肽含量,g/l00mL；m1，酸溶蛋白質水解物含量,g/l00mL；m2，游離氨基酸含量,g/l00mL。

1.3.2 低聚肽相對分子質量分布分析[16-17]

采用高效液相色譜法對小麥低聚肽相對分子質量進行分析，色譜條件如下:色譜柱：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1；檢測波長：UV 220 nm；體積流量 0.5 mL/min，柱溫 30 ℃，進樣體積 10 μL。4 種不同相對分子質量的肽標準品為：細胞色素C(MW12 500)，桿菌酶(MW1 450)，乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)，乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)。

1.3.3 低聚肽的氨基酸組成分析[18]

將方法1.3.1得到的酸溶蛋白質充分水解后，采用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成，按照公式(2)計算低聚肽的氨基酸組成含量：

Xk=Xk(1)-X(k2)

(2)

式中：Xk，低聚肽中k型氨基酸含量,g/l00mL；Xk(1)，酸溶蛋白質水解物中k型氨基酸含量,g/l00mL；Xk(2)，游離氨基酸中k型氨基酸含量,g/l00mL；k，某一種氨基酸類型。

1.4 數據分析

采用SPSS v19.0軟件進行統計分析，數據結果以“平均值±標準差”(n=3)表示，Duncan法進行顯著性分析，p<0.05表示數據間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 低聚肽含量測定

依據釀造醬油GB 18186—2000對3個樣品進行了基本指標的檢測，如表2所示。樣品1和2中氨基酸態氮均大于0.8 g/100mL，無鹽固形物含量均大于15 g/100mL，且全氮含量均大于1.50 g/100mL，表明樣品1和2屬于特級醬油，而樣品3醬油中氨基酸態氮、無鹽固形物和全氮含量均符合三級醬油標準。

樣品2中酸溶蛋白質水解物和游離氨基酸含量分別為12.10 g/100mL和9.06 g/100mL，均顯著高于樣品1和3。且樣品2由于外源添加了谷氨酸鈉的緣故，其谷氨酸含量高達5.42 g/100mL，分別是樣品1和3的12.04倍和20.85倍，占酸溶蛋白質水解物和游離氨基酸的比例分別高達44.79%和59.82%。醬油低聚肽測定結果如表2所示，無添加醬油樣品1的低聚肽含量最高，為6.79g/100mL，顯著高于樣品2(3.04 g/100mL)和樣品3(2.95 g/100mL)，分別是樣品2和3的2.23倍和2.30倍。

表2 醬油相關指標的測定 單位：g/100mL

注：小寫字母不同表示數據間差異顯著(p<0.05)。

2.2 低聚肽相對分子質量分布

肽標準品的凝膠過濾色譜圖如圖1所示，lgMW為縱坐標，保留時間t為橫坐標，肽分子量的標準曲線為lgMW=-0.200t+6.689，R2=0.996 6。

1-細胞色素C(MW 12 500);2-桿菌酶(MW 1 450); 3-乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451);4-乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189)圖1 不同相對分子質量的肽標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of peptides with different relative molecular mass

醬油低聚肽分子質量分布如表3所示，樣品1、2和3醬油低聚肽分子質量大多在1 000 Da以下，占比分別為95.26%、97.14%和89.07%，3者之間無明顯差異。以氨基酸平均分子質量為137計算，推測醬油低聚肽主要由六肽以下的小分子肽段構成。研究表明，小肽分子更容易快速通過小腸薄膜被人體吸收利用，進而發揮其保健功能[19-20]。樣品1、樣品2和樣品3醬油中分子質量140～500 Da的活性低聚肽占比分別為47.47%、35.82%和36.04%，多為易被人體吸收的二肽和三肽，研究表明小分子的肽段具有較高的抗氧化活性[21]。樣品1、樣品2和樣品3醬油活性低聚肽含量分別為3.22、1.09和1.06 g/100mL，樣品1醬油活性低聚肽含量分別是樣品2、樣品3的2.95和3.03倍。

表3 醬油低聚肽分子質量分布 單位：%

2.3 低聚肽氨基酸組成分析

醬油低聚肽的氨基酸組成分析結果(圖2)可知，醬油低聚肽氨基酸組成種類豐富。對3款醬油低聚肽的氨基酸質量濃度進行了比較分析，樣品1中排名前4位的水解氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸和甘氨酸，樣品2中排名前4位為谷氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和脯氨酸，樣品3中排名前4位為谷氨酸、天冬氨酸、纈氨酸和脯氨酸。3種醬油水解氨基酸含量差異較大，其中谷氨酸和天冬氨酸占比例較多，這與原料中組成蛋白質的氨基酸比例有很大關系，其中大豆蛋白質中谷氨酸和天冬氨酸含量較多，而蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸含量很少[22]。

圖2 醬油低聚肽的氨基酸組成Fig.2 Amino acid composition of oligopeptides in soy sauce

醬油低聚肽氨基酸組成中富含人體所需的8種必需氨基酸，如表4所示，樣品1醬油多肽必需氨基酸總量為1.229 g/100mL，占總氨基酸的32.45%，而樣品2和樣品3醬油多肽必需氨基酸總量僅分別為0.589 g/100mL和0.468 g/100mL。樣品1醬油多肽必需氨基酸總量分別是樣品2和樣品3的2.08和2.63倍。賴氨酸為堿性必需氨基酸，是人體的第一必需氨基酸，具有增強免疫力、促進人體生長發育、提高中樞神經組織功能等作用[23-24]。但由于谷物食品中的賴氨酸含量較低，且在食品加工過程中易被破壞而缺乏，故稱為第一限制性氨基酸。樣品1醬油多肽中賴氨酸含量為0.153 g/100mL，是樣品2和樣品3的4.37和30.60倍。

表4 醬油低聚肽必須氨基酸的組成 單位：g/100mL

3 結論

本文首次測定了無添加醬油中低聚肽含量、分子質量分布及其氨基酸組成，并與特級和三級普通釀造醬油樣品進行了比較分析。結果顯示無添加醬油低聚肽含量為6.79 g/100 mL，其中活性低聚肽(分子質量140～500)組分高達47.47%，顯著高于特級和三級普通釀造醬油樣品。無添加醬油多肽必需氨基酸總量分別是特級和三級醬油樣品的2.08和2.63倍，其中賴氨酸在3款醬油低聚肽中的含量差異極顯著，賴氨酸可作為一種特征性氨基酸來區分無添加醬油與普通釀造醬油。因此，無添加醬油中低聚肽含量更高，尤其是活性低聚肽，且人體必需氨基酸含量更豐富。

綜上，本研究在醬油常規檢測指標(氨基酸態氮、全氮、可溶性無鹽固形物等)基礎上，提出了更加深入的醬油品質評價指標——低聚肽，為科學評價釀造醬油的營養及品質提供新的研究思路。

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