QuEChERS結合高效液相色譜串聯質譜快速檢測速溶茶粉中八種農藥殘留

鮑鏖天，裴少芬，唐杏燕，王曉霞，邵增瑯

(南京融點食品科技有限公司，江蘇 南京，211300)

速溶茶粉是以茶葉或茶鮮葉為主要原料，經過萃取、過濾、濃縮和干燥等工藝制成的茶葉深加工產品，由于具有沖調速溶、易與其他食品調配等特點，近年來取得了高速發展[1]。

溫濕的茶園環境和較高的茶樹種植密度使得茶樹很容易滋生病蟲害，現階段以施用農藥為主的防治措施又必然會帶來農藥殘留問題[2]。以茶葉為原料生產速溶茶粉的過程中還會發生農藥殘留富集現象。以茶葉為參照，歐盟等主要進口國對速溶茶粉中的農藥最高殘留限量(maximum residue limit，MRL)要求非常嚴苛，我國最新修訂的國標中也針對茶葉新增了多種農藥檢測項目[3-4]。但是目前針對速溶茶粉中農藥殘留檢測的報道非常少。

為了保證速溶茶粉的質量安全和順利出口，必須建立起檢測速溶茶粉中農藥殘留的方法。速溶茶粉中含有源于茶葉的多種成分(茶多酚、咖啡堿等)和加工過程中添加的多種輔料(檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉等)，基質成分相比茶葉更加復雜。液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)的高選擇性、高靈敏度等特點使其適于檢測基質成分復雜樣品中的痕量農藥殘留[5]。QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)方法是一種簡單、快速的樣品前處理技術，近年來被廣泛應用于農產品的農藥殘留檢測[6]。2017年6月開始實施的GB 2763—2016針對茶葉增加了多項農藥殘留檢測項目，其中克百威、內吸磷、滅線磷、甲胺磷、辛硫磷、吡蚜酮、硫環磷、氯唑磷使用了LC-MS/MS方法進行檢測[4]。本文采用QuEChERS方法對速溶茶粉進行前處理，探索建立適合同時檢測速溶茶粉中這8種農藥殘留的HPLC-MS/MS方法，以期實現對速溶茶粉中這8種農藥殘留的準確、快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

NaCl、MgSO4(AR級)，國藥集團化學試劑有限公司；MgSO4、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)：上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈、甲酸：LC-MS級，美國Sigma-Aldrich公司；尼龍有機相微孔濾膜：0.22 μm，德國C&B公司。

克百威(carbofuran)、內吸磷(demeton(o+s))、滅線磷(ethoprophos)、甲胺磷(methamidophos)、辛硫磷(phoxim)、吡蚜酮(pymetrozine)、硫環磷(phosfolan)和氯唑磷(isozofos)標準品：100 μg/mL，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設備

AL204電子分析天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XW-80A旋渦混合儀,金壇希望科研儀器有限公司；RJ-TGL-1650臺式高速離心機,無錫瑞江分析儀器有限公司；明澈TM-D 24UV超純水系統,美國Merck Millipore公司；1260-6420液相色譜串聯質譜儀,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 質譜條件

電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)；干燥氣(氮氣)流速和溫度分別為10 L/min和350 ℃；霧化氣壓力為；毛細管電壓為3 500 V。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.7 μm，3.0 mm×50 mm)；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min。

流動相A：乙腈(含0.1%甲酸)；流動相B：水(含0.1%甲酸)。

梯度洗脫程序：0～2 min，10% A；2～3 min，10%～60% A；3～10 min，60% A；10～11 min，60%～90% A；11～15 min，90% A；15～16 min，90%～10% A；16～20 min，10% A。

1.3.3 樣品前處理

稱取1 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入5 mL去離子水和10 mL乙腈，旋渦振蕩3 min，加入2.5 g NaCl，旋渦振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min。

移取1 000 μL上層乙腈提取液加入到裝有150 mg MgSO4、50 mg PSA和50 mg GCB的2 mL離心管中，旋渦振蕩1 min，15 000 r/min離心5 min，移取200 μL凈化液至2 mL離心管中，加入800 μL超純水，旋渦振蕩1 min后過微孔濾膜備用。

1.3.4 溶液配制

混合標準儲備溶液：分別移取100 μL 100 μg/mL農藥標準溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 μg/mL混合標準儲備溶液。4 ℃下避光保存。

混合標準溶液：移取100 μL混合標準儲備溶液于2 mL的離心管中，加入900 μL超純水，配制成100 ng/mL混合標準溶液；移取100 μL 100 ng/mL混合標準溶液于2 mL離心管中，加入900 μL超純水，配制成10 ng/mL混合標準溶液。混合標準溶液現配現用。

溶劑標準工作液：分別移取200 μL乙腈于2 mL離心管中，再移取相應濃度和體積的混合標準溶液于各離心管中，加水至1 mL，旋渦振蕩1 min后過微孔濾膜，配制成0.2、0.5、1、5、10和50 ng/mL溶劑標準工作液。

基質匹配標準工作液：分別移取200 μL空白基質凈化液(按1.3.3提取、凈化)于2 mL離心管中，再移取相應濃度和體積的混合標準溶液于各離心管中，加水至1 mL，旋渦振蕩1 min后過微孔濾膜，配制成0.2、0.5、1、5、10和50 ng/mL基質匹配標準工作液。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

ESI+模式下，用全掃描、單離子監測掃描和子離子掃描優化各化合物母離子的碎裂電壓(fragmentor)和子離子的碰撞能(collision energy，CE)。空白基質進樣，多重反應監測模式(multiple reaction monitoring，MRM)下發現，在滅線磷243.1>173.0的離子通道上存在基質干擾，在其他離子通道上均沒有基質干擾。參考BOTERO-COY等檢測土壤中草甘膦時遇到基質干擾時的試驗方法，雖然子離子173.0的響應高于96.9的響應，但選擇沒有基質干擾的243.1>96.9作為滅線磷的定性離子對[7]。其他7種化合物均選擇響應最高的2個子離子作為定量和定性離子。優化后的質譜MRM參數見表1。

表1 8種農藥的MRM參數Table 1 The MRM parameters of the 8 kinds of pesticides

注：*為定量離子。

2.2 液相色譜條件的優化

2.2.1 流動相的選擇

為了減小溶劑效應，選擇與萃取溶劑相同的乙腈作為有機相[8]。ESI+模式下，在LC-MS/MS的流動相加入揮發性的酸可以提供H+，從而提高目標化合物的離子化效率[6]。綜合考慮色譜柱的pH耐受范圍和目標化合物的離子化效率，分別在有機相和水相中加入0.1%的甲酸。

2.2.2 洗脫梯度的優化

吡蚜酮的提取離子流圖(extracted ion current，EIC)如圖1所示。在1～2 min有機相比例為5%的條件下，吡蚜酮的峰型發生裂分，表現出很強的溶劑效應[8-9]。將1～2 min有機相比例提高到10%，吡蚜酮峰型裂分現象消失，峰型良好。8種農藥的總離子流圖(total ion current，TIC)如圖2所示。由圖2可知，2～3 min有機相比例快速提高到60%后并維持7 min，8種農藥在10 min內全部出峰且基本分離開。質譜檢測與色譜檢測不同，不需要通過色譜將各目標化合物完全分離，但保證目標化合物具備一定分離度可以減小基質與目標化合物共流出的概率，從而減小目標化合物離子化時的基質干擾[10]。

圖1 吡蚜酮的提取離子流圖Fig.1 The EIC of the pymetrozine

圖2 8種農藥的總離子流圖Fig.2 The TIC of the 8 kinds of pesticides

2.3 前處理條件的優化

2.3.1 鹽的選擇

圖3 不同鹽對農藥回收率的影響Fig.3 The influence of different salt on recoveries of pesticides

2.3.2 凈化劑的選擇

PSA可以顯著吸附茶葉中的茶多酚和葉綠素，GCB可以顯著吸附茶葉中的咖啡堿并凈化提取液的顏色[13]。在1.3.3的樣品前處理過程中分別加入150 mg MgSO4+50 mg PSA和150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB，試驗重復3次[6]。各農藥回收率試驗結果如圖4所示。以MgSO4+PSA+GCB作為凈化劑時，吡蚜酮和辛硫磷的平均回收率分別只有37.7%和54.1%，而以MgSO4+PSA作凈化劑時，2種化合物的平均回收率分別為108.5%和92.3%。這可能是因為吡蚜酮和辛硫磷的分子結構的平面化程度比較高(2種化合物均含有環狀平面結構)，凈化過程中對平面化合物具有吸附作用的平面層狀結構的GCB吸附了這2種化合物[6]。綜合考慮8種農藥的回收率，本文選擇使用MgSO4+PSA。

圖4 不同凈化劑對農藥回收率的影響Fig.4 The influence of different adsorbent on recoveries of pesticides

2.4 基質效應

基質效應(matrix effect，ME)嚴重影響LC-MS/MS分析的準確性。KMELLR等用基質匹配標準曲線的斜率和溶劑標準曲線的斜率的差異(%)來衡量基質效應的強弱，ME>20%表明有比較強的基質增強效應，ME<-20%表明有比較強的基質抑制效應[14]。

雖然本文通過凈化提取液、色譜分離和基質稀釋等方法減弱了基質效應，但如表2所示，樣品中的吡蚜酮和甲胺磷仍然表現出較強的基質抑制效應。反相色譜分離時最初流出的主要是基質中的極性成分，可能這些成分大幅降低了吡蚜酮和甲胺磷在ESI源中的離子化效率，造成了較強的基質抑制效應[15-16]。本文利用基質匹配標準曲線來消除基質效應對定量分析的影響，以獲得更準確的定量結果。

2.5 回收率和精密度

各農藥的基質匹配標準曲線方程如表2所示。在LOQ～50 ng/mL范圍內，8種農藥的線性關系良好(R2均大于0.996)。

表2 農藥的線性方程、相關系數(R2)、LOQs、線性范圍和METable 2 The linear equations, coefficients of determination (R2), LOQs， linear ranges and ME obtained for pesticides

在1 LOQ和4 LOQ兩個濃度添加水平下進行8種農藥的回收率和精密度試驗，試驗重復6次[17]。回收率和精密度試驗結果如表3所示。在2個濃度添加水平下吡蚜酮的平均回收率分別為61%和63%，回收率偏低。這可能是因為速溶茶粉中的一些成分對吡蚜酮有吸附作用，造成乙腈萃取吡蚜酮的效率偏低。8種農藥在2個濃度添加水平下的平均回收率均在61%～118%，RSD均在0.9%～10.5%，符合美國分析家化學協會(AOAC)對于農產品中農藥殘留檢測分析的要求(回收率在50%～150%，RSD<15%)[6]。本方法的方法定量限小于或等于國標和歐盟法令對茶葉及相關制品中這8種農藥最大殘留限量的要求[18-21]。本方法可以滿足對速溶茶粉中這8種農藥殘留檢測的要求。

2.6 實際樣品的測定

表3 農藥的回收率和精密度Table 3 The recoveries and RSDs of pesticides spiked atlow and high concentrations

應用本方法檢測10個批次用低農藥殘留茶葉生產的速溶茶粉和10個批次用普通茶葉生產的速溶茶粉。在10個批次的低農速溶茶粉中均沒有檢出這8種農藥殘留。在1個批次的普通速溶茶粉中檢出了0.032 mg/kg的甲胺磷殘留，雖然低于國標和歐盟法令的要求(0.05 mg/kg和0.1 mg/kg)，但速溶茶粉中檢出高毒的禁用農藥仍應引起足夠的重視。

3 結論

本文研究建立了QuEChERS前處理結合HPLC-MS/MS技術快速檢測速溶茶粉中8種農藥殘留的方法，系統優化了方法中的質譜、色譜和前處理條件。良好的線性關系、回收率和精密度等指標表明本方法可以對速溶茶粉中的這8種農藥殘留進行準確的定量檢測。同時本方法靈敏度高、快速、消耗的有機溶劑少，以本方法為基礎可以進一步開發速溶茶粉中其他多種農藥殘留快速檢測的方法。

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