早補救ICSI在部分受精失敗患者中的臨床應用

蔣益群，王珊珊，徐志鵬，張寧媛

(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心，南京 210008)

我國生育年齡的夫婦發生不孕不育的比例越來越高，常規IVF是治療不孕不育的有效手段。IVF受精率低甚至受精完全失敗的情況不可避免，不僅會影響妊娠結局，也會給不孕患者帶來經濟及身心負擔。最早，晚補救ICSI(R-ICSI)被應用于第1天的未受精卵母細胞。然而，考慮到較低的胚胎發育潛能和臨床妊娠率，晚R-ICSI逐漸被淘汰[1-2]。2003年Chen和 Kattera[3]首次將早R-ICSI用于臨床，在IVF 6 h后觀察有無排出第二極體，判斷受精狀況，并對無第二極體的卵母細胞行早R-ICSI，可有效避免完全受精失敗。張寧媛等[4-5]通過短時受精聯合早R-ICSI顯著改善了常規IVF周期中完全受精失敗患者的臨床結局。Chen等[6]和Huang等[7]進一步論證了早R-ICSI用于完全受精失敗患者其圍產期結局安全有效。

然而，臨床上也會出現部分受精失敗的病例。對于部分受精失敗患者，如果卵母細胞未受精比例較少且有可移植胚胎，是可以接受的。但如果卵母細胞未受精比例較高，會導致胚胎利用率降低，甚至造成患者取消移植周期。因此，本研究回顧性分析部分受精失敗的病例行早R-ICSI后的胚胎發育潛能以及臨床妊娠結局。

資料與方法

一、研究對象

對2013～2015年在本院生殖醫學中心行常規IVF，部分受精失敗行早R-ICSI的320例患者(320個周期)的臨床資料進行回顧性分析。根據短時受精后雙極體(2PB)率分為3組：A組2PB率<25%(n=113)；B組25%≤2PB率<50%(n=151)；C組2PB率≥50%(n=56)。比較3組R-ICSI來源卵母細胞的受精率、卵裂率、優質胚胎率以及臨床妊娠率。

二、控制性促排卵方案

采用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，曲普瑞林，Ferring，德國)降調節后，注射基因重組促卵泡激素(Gonal-F，果納芬，雪蘭諾，瑞士)，當發現至少1個卵泡直徑>18 mm時，注射HCG(Serono，瑞士)，并于35～36 h后經陰道B超引導下穿刺取卵。

三、精液處理

手淫法收集精液，液化后用精子梯度離心液400g離心20 min，將沉淀置于3 ml精子洗滌液(Vitrolife，瑞典)中，200g離心10 min棄去上清，加受精培養液(Vitrolife，瑞典)0.5 ml上游。0.5 h后，調節精子濃度至 1×106/ml等待受精。

四、短時受精及早R-ICSI

卵泡穿刺獲得卵冠丘復合物，置于受精培養液(Vitrolife，瑞典)中培養3 h，按10 000精子/卵母細胞的比例加精，精卵共孵育4～5 h后脫顆粒細胞。根據是否存在第二極體判斷受精情況，若2PB數相對成熟卵母細胞數的比例<60%，在6 h后對未受精卵母細胞行早R-ICSI。然后轉移至卵裂培養液(Vitrolife，瑞典)。16～18 h后觀察原核(PN)形成情況。受精后第2天(D2)及D3評估分裂胚質量。然后轉移至囊胚培養液(Vitrolife，瑞典)中，受精后D5和D6在倒置顯微鏡下評估囊胚質量。

五、胚胎評估

根據我中心常規評分方法進行分裂胚及囊胚的評估[8]，挑選優質胚胎移植或冷凍保存。

六、胚胎移植與妊娠結局判斷

取卵后D3挑選兩枚優質分裂胚，于B超引導下進行宮腔內胚胎移植，予以常規黃體支持。移植后剩余的優質胚胎冷凍保存或繼續培養至D5/D6形成囊胚后冷凍保存。胚胎移植后14 d檢測血清HCG指標，陽性結果確定為生化妊娠。移植后28 d行B超檢查，見宮腔內有妊娠囊者確診為臨床妊娠。

七、統計學處理

結 果

一、患者的一般資料比較

A、B、C 3組患者的女方年齡、不育年限、體重指數(BMI)、促性腺激素(Gn)用量、Gn天數、獲卵數、成熟卵母細胞數比較均無顯著性差異(P0.05)(表1)。

二、不同2PB率對受精及胚胎發育潛能的影響

A、B、C 3組患者的早R-ICSI正常受精率[即觀察到雙原核(2PN)率]比較無顯著性差異(P0.05)，A組的異常受精率(即≥3PN率)顯著低于B、C兩組(P<0.05)，C組的2PN卵裂率和優質胚胎率顯著低于A、B兩組(P<0.05)，3組囊胚形成率及優質囊胚率比較無顯著性差異(P0.05)。A、B、C 3組中早R-ICSI來源胚胎用于移植的比例兩兩比較有顯著性差異(P<0.05)，且早R-ICSI來源胚胎中優質胚胎的比例兩兩比較亦有顯著性差異(P<0.05)(表2)。

三、3組患者移植胚胎來源及妊娠結局的比較

3組中因存在卵巢過度刺激綜合征(OHSS)發生風險及無可用胚胎放棄移植的例數見表3。A、B、C 3組患者的臨床妊娠率、種植率、流產率及異位妊娠率比較均無顯著性差異(P0.05)，A、B、C 3組患者移植兩枚早R-ICSI來源胚胎的周期比例兩兩比較有顯著性差異(P<0.05)，移植兩枚IVF來源胚胎的周期比例兩兩比較亦有顯著性差異(P<0.05)；IVF和早R-ICSI各移植1枚的周期比例C組顯著低于A、B組(P<0.05)(表3)。

表1 各組患者一般臨床資料比較(-±s)

表2 各組患者行早R-ICSI卵母細胞的受精及胚胎發育情況比較(%)

注：與A、B兩組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05。a早R-ICSI移植胚胎比例=早R-ICSI移植胚胎數/(早R-ICSI移植胚胎數+IVF移植胚胎數)；b早R-ICSI優質胚胎比例=早R-ICSI優質胚胎數/(早R-ICSI優質胚胎數+IVF優質胚胎數)

表3 各組患者移植胚胎來源及臨床妊娠結局比較(n，%)

注：與A、B兩組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05

討 論

受精過程包括精子和卵母細胞接觸與識別、精子穿入的調節、受精卵激活、卵母細胞對精子處理、原核形成過程[9]。受精失敗的主要原因是精子與透明帶結合失敗或精子未成功穿入透明帶，另一個原因是精子穿入透明帶后受精終止，若卵母細胞完成受精，在其內精子的穿入過程和正確的信號級聯反應尤為重要[10-12]。對于部分受精失敗者，精子功能的缺陷仍然是受精失敗的主要原因[13-14]，卵母細胞質量的缺陷對受精的影響可能更明顯[15]。劉蘭蘭等[16]的研究顯示：R-ICSI與常規IVF相比，原發性不育因素比例較高，不育年限較長，提示R-ICSI患者自身的卵母細胞或精子質量可能存在缺陷，影響受精。劉琨等[17]的研究表明高Gn用量可能導致胞質發育不成熟或核質發育不同步，損傷卵母細胞內部結構，影響受精狀況。如果受精失敗是在精子與透明帶結合時造成的，則R-ICSI可能起作用；如果精子能夠成功地穿透卵母細胞，但在隨后的卵母細胞激活和原核形成過程中遇到困難，則R-ICSI將是無效的[18]。

本研究結果顯示，B、C組的異常受精率顯著高于A組，可能是由于在部分受精失敗的病例中，碎片化的極體或者假雙極體都會增加判斷受精的難度；C組卵裂率和優質胚胎率均顯著低于A、B兩組，也提示隨著2PB率的增加，3組未受精卵母細胞的胞質成熟狀況將逐漸變差，其染色體異常風險可能有所提高。Cao等[19]認為對于IVF受精率超過25%的患者，不推薦使用ICSI，因為可能與多倍體風險及胚胎利用率低有關。本研究結果中：B組早R-ICSI來源的胚胎提供了48.61%的移植胚胎，55.74%的優質胚胎。在B組108個移植周期中，有25個周期(23.15%)移植兩枚早R-ICSI胚胎，有55個周期(50.93%)移植1枚早R-ICSI胚胎；而C組中早R-ICSI來源的胚胎比例較低，認為早R-ICSI對C組的妊娠結局貢獻較小。因此，認為當短時受精后2PB率<50%時，早R-ICSI可以獲得較理想的優質胚胎率及妊娠結局。C組患者早R-ICSI胚胎的異常受精率顯著增高，卵裂率和優質胚胎率顯著降低，可能與未受精卵母細胞的染色體異常，促排卵過程使卵母細胞發生紡錘體異常，第一、二極體的排出障礙，卵母細胞不成熟或成熟阻滯有關[20]，也有研究認為受精失敗的發生與卵母細胞過度成熟有關[21]。

張微等[22]的研究顯示：只有一個極體出現的卵母細胞，6 h受精卵皮質反應出現率為66.67%，其受精率也達到37.50%。同時，當IVF受精率越高，早R-ICSI的異常受精率也越高，極體發生碎裂或出現假的雙極體時，可結合胞漿的皮質反應情況、卵周間隙的改變等綜合判斷卵母細胞受精情況，如果極體延遲排出，只能延長觀察時間。這將增加額外的工作量，同時反復的體外觀察，也會對胚胎質量有一定影響。Nagy等[23]的研究結果表明，在卵母細胞失去發育潛能之前進行R-ICSI更有效。Liu等[24]的研究也表明，R-ICSI時機越早，其臨床結局越好。因此，提高IVF術后短時間識別未受精卵母細胞的準確度，尤其重要。

偏振光顯微成像技術能夠提高早R-ICSI結果，該技術能辨別顯示單極紡錘體(MⅡ)和雙極紡錘體的卵母細胞(可能表現為精子穿入)。對只顯示1個紡錘體的未受精卵母細胞進行注射，其正常受精率更高，從而提高整體治療效果[25]。Guo等[26]的研究表明，在受精后的5 h內，偏振光顯微成像技術與早R-ICSI相結合，可以有效地減少多倍體發生，同時減少體外觀察時間。因此，偏振光顯微成像技術可能對獲卵較少的病例或者2PB比例大于50%的病例中受精判斷困難的情況有一定的幫助。

本研究中部分受精失敗的樣本量較少，且混合移植的存在造成難以對妊娠及圍產期結局進行分析，因此本文著重于對IVF來源和早R-ICSI來源胚胎的使用進行比較。在以后的工作中，將大樣本調查單胚胎移植中早R-ICSI患者的圍產期結局，以進行安全性評估。

【參 考 文 獻】

[1] Yuzpe AA，Liu Z，Fluker MR. Rescue intracytoplasmic sperm injection(ICSI)-salvaging in vitro fertilization(IVF)cycles after total or near-total fertilization failure[J].Fertil Steril，2000，73：1115-1119.

[2] Morton PC，Yoder CS，Tucker MJ，et al. Reinsemination by intracytoplasmic sperm injection of 1-day-old oocytes after complete conventional fertilization failure[J].Fertil Steril，1997，68：488-491.

[3] Chen C，Kattera S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6h post-insemination in conventional IVF[J].Hum Reprod，2003，18：2118-2121.

[4] 張寧媛，孫海翔，胡婭莉，等.完全受精失敗周期應用早期補救性卵細胞胞質內單精子注射術的安全性評估[J].中華男科學雜志，2010，16：158-160.

[5] 張寧媛，孫海翔，胡婭莉，等.短時受精聯合早期補救性卵細胞胞質內單精子注射在完全受精失敗周期的臨床應用[J].中華男科學雜志，2009，15：538-541.

[6] Chen L，Xu Z，Zhang N，et al. Neonatal outcome of early rescue ICSI and ICSI with ejaculated sperm[J].J Assist Reprod Genet，2014，31：823-828.

[7] Huang B，Qian K，Li Z，et al. Neonatal outcomes after early rescue intracytoplasmic sperm injection：an analysis of a 5-year period[J].Fertil Steril，2015，103：1432-1437.

[8] 蔣益群，王珊珊，徐志鵬，等.商品化培養液對人類胚胎發育及妊娠結局的影響[J].中國醫藥導報，2016，13：72-75.

[9] Beck-Fruchter R，Lavee M，Weiss A，et al. Rescue intracytoplasmic sperm injection：a systematic review[J].Fertil Steril，2014，101：690-698.

[10] Rawe VY，Olmedo SB，Nodar FN，et al. Cytoskeletal organization defects and abortive activation in human oocytes after IVF and ICSI failure[J].Mol Hum Reprod，2000，6：510-516.

[11] Mahutte NG，Arici A. Failed fertilization：is it predictable?[J].Curr Opin Obstet Gynecol，2003，15：211-218.

[12] Tosti E，Menezo Y. Gamete activation：basic knowledge and clinical applications[J].Hum Reprod Update，2016，22：420-439.

[13] Li LJ，Zhang FB，Liu SY，et al. Human sperm devoid of germinal angiotensin-converting enzyme is responsible for total fertilization failure and lower fertilization rates by conventional in vitro fertilization[J].Biol Reprod，2014，90：125.

[14] Goudakou M，Kalogeraki A，Matalliotakis I，et al. Cryptic sperm defects may be the cause for total fertilization failure in oocyte donor cycles[J/OL]. Reprod Biomed Online，2012，24：148-152.

[15] Coticchio G，Dal Canto M，Mignini Renzini M，et al. Oocyte maturation：gamete-somatic cells interactions，meiotic resumption，cytoskeletal dynamics and cytoplasmic reorganization[J].Hum Reprod Update，2015，21：427-454.

[16] 劉蘭蘭，蔡嘉力，任建枝.早期補救ICSI對首次IVF助孕周期臨床結局的影響[J].生殖醫學雜志，2016，25：118-122.

[17] 劉琨，胡俊平，馬曉玲，等.體外授精中卵母細胞受精失敗因素分析及早期補救ICSI的應用探討[J].生殖醫學雜志，2016，25：619-622.

[18] Yeste M，Jones C，Amdani SN，et al. Oocyte activation deficiency：a role for an oocyte contribution?[J].Hum Reprod Update，2016，22：23-47.

[19] Cao S，Wu X，Zhao C，et al. Determining the need for rescue intracytoplasmic sperm injection in partial fertilisation failure during a conventional IVF cycle[J].Andrologia，2016，48：1138-1144.

[20] 趙芳，呂玉珍，王娟，等.常規IVF完全/部分受精失敗后行早期補救ICSI的應用價值[J].生殖醫學雜志，2015，24：87-92.

[21] 黃玉玲，龍曉林，劉見橋，等.體外受精-胚胎移植中完全受精失敗的原因分析[J].生殖與避孕，2011，31：455-458.

[22] 張微，宋成，成金泉，等.卵子受精早期現象的初步探討[J].生殖醫學雜志，2009，18：197-202.

[23] Nagy ZP，Rienzi LF，Ubaldi FM，et al. Effect of reduced oocyte aging on the outcome of rescue intracytoplasmic sperm injection[J].Fertil Steril，2006，85：901-906.

[24] Liu W，Liu J，Zhang X，et al. Short co-incubation of gametes combined with early rescue ICSI：an optimal strategy for complete fertilization failure after IVF[J].Hum Fertil(Camb)，2014，17：50-55.

[25] Asa E，Tabatabaee R，Farrokhi A，et al. Relationship between meiotic spindles visualization and intracytoplasmic sperm injection outcomes in human oocytes[J].Anat Cell Biol，2017，50：26-32.

[26] Guo Y，Liu W，Wang Y，et al. Polarization microscopy imaging for the identification of unfertilized oocytes after short-term insemination[J].Fertil Steril，2017，108：78-83.