血管瘤血管內皮細胞體外分離純化方法的優化

稂翠玲 孫斌 雷紅召 馬玉春 董長憲

[摘要]目的：尋找更高效的嬰幼兒血管瘤內皮細胞培養方法，為嬰幼兒血管瘤的研究提供基礎的科研保證。方法：選取增生期嬰幼兒血管瘤手術標本，采用組織塊貼壁法與酶消化法結合進行原代培養；二代細胞進行流式分選，取CD31陽性的細胞繼續培養。分別進行細胞形態學觀察、細胞表面標記物免疫熒光鑒定、細胞表面標記物流式鑒定。結果：培養48～72h清晰可見組織塊周圍細胞游出，細胞核清晰，細胞呈長梭形及多邊形，2周左右部分可形成“血管腔樣”結構，20d可鋪滿平傳代；細胞流式測定CD31陽性率達98.4%，VWF與CD31雙陽率90.3%，免疫熒光染色CD31、VWF均呈陽性表達。結論：組織塊與消化結合法經流式分選后可獲得高純度的內皮細胞，為下一步研究嬰幼兒血管瘤增生消退機制奠定了基礎。

[關鍵詞]嬰幼兒血管瘤；細胞培養；流式分選；組織塊與酶消化法；血管瘤內皮細胞

[中圖分類號]R732.2 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）04-0061-03

Flow Separation was Combined with Tissue Block and Digestion to Train the Endothelial Cells of Hemangioma

LANG Cui-ling， SUN Bin， LEI Hong-zhao， MA Yu-chun， DONG Chang-xian

（Department of Hemangioma Surgery，Henan University Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，Henan，China）

Abstract： Objective To explore the endothelial cell culture method of more efficient infant hemangioma ，to provide the basic research guarantee for the research of hemangioma of infants. Methods In order to select the surgical specimens of the hemangioma of the hyperplasia， the primary culture was carried out by means of Tissue block adherent and enzyme digestion. Two generations of cells were selected for flow separation， and CD31 positive cells continued to be cultured.It were respectively carried out to observe the cell of morphology， immunofluorescence identification of cell surface marker， of fluid identification of cell surface marker. Results The cells in the tissue block around the tissue block could be clearly visible from 48-72 hours. The nuclei were clear， the cells were long fusiform and polygons， and the portion could form "blood vessel cavity" structure in about 2 weeks. The positive rate of CD31 was 98.4%， the VWF and CD31 were 90.3%， and the immunofluorescence staining CD31 and VWF were positive. Conclusion The high purity endothelial cells can be obtained after the flow separation of the means of tissue block and digestive association， which lays the foundation for the next study on the mechanism of proliferation and regression of hemangioma of infants.

Key words： infant hemangioma； cell culture ； flow separation；tissue block and enzyme digestion method； hemangioma endothelial cells

嬰幼兒血管瘤（Infantile hemangioma）是來源于內皮細胞的先天性良性腫瘤，好發于面頸部（60%）[1-2]，可造成皮膚色素沉著，瘢痕甚至畸形等，但其病因和發病機制目前并不清楚[3-4]，組織病理學證實血管瘤增生期可發現大量微血管內皮細胞增生[5-6]。嬰幼兒血管瘤研究的標本大多數來源于病理組織，若進行分子生物學水平研究，則純度不足。因此，要從細胞生物學、分子生物學研究血管瘤的發病機制、提純目的細胞，嬰幼兒血管瘤體外細胞培養是關鍵一步。本次實驗采用組織塊貼壁法與酶消化法結合，經流式細胞儀分選培養原代內皮細胞取得了較理想的結果，現將該方法報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗標本：3～6個月齡增生期嬰幼兒血管瘤手術標本（由筆者醫院提供），經臨床及病理科醫生確診，倫理審查通過，已簽知情同意書。

1.2 實驗器材：手術刀、眼科剪、24孔板、血細胞計數板、離心機（湘儀 L1500）、超凈臺（美國）、倒置相差顯微鏡（日本）、5%CO2培養箱（美國）、水浴鍋（金壇市華峰）、熒光顯微鏡（日本）、流式分選儀（Beckman Coulter Moflo- 美國）、流式檢測儀（BD美國）等。

1.3 實驗試劑：EGM-2培養基（美國）、胎牛血清（Hyclone，美國）、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美國）、PBS液（索萊寶，國產）、兔抗人VWF單抗（Abcam，英國）、鼠抗人CD31單抗（Biolegend，美國）、DAPI（索萊寶，國產）、封片膠（美國）、破膜劑（翊圣，上海）、10%山羊血清（索萊寶，國產）、4%多聚甲醛、甲醇等。

1.4 方法

1.4.1 原代內皮細胞培養：將手術取出的新鮮標本放入含雙抗的PBS液的離心管內，立即送到細胞室的超凈臺，用含雙抗的PBS液沖洗3～5遍，液體直至肉眼觀澄清液體為止；用手術刀切成約為3mm3大小的組織塊，用PBS液洗2～3遍，然后用0.25%胰蛋白酶在37℃水浴鍋振蕩消化15～20min；眼科剪剪約為1mm3大小組織塊放入培養瓶，置37℃、5%CO2培養箱4～6h后加入1.5ml含10%的FBS的EGM-2培養基進行培養，24h補加培養基。以后每隔1～2d換一次液。

1.4.2 細胞形態學觀察：每日在倒置相差顯微鏡下觀察培養內皮細胞的形態變化。

1.4.3 流式細胞分選：取二代內皮細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，PBS洗一遍后CD31單抗（1︰200）室溫孵育40～60min，進行細胞計數板計數（1×107/ml），用70μm的細胞過濾網進行過濾，移入流式管中，避光置冰上送分選室，進行分選，留取CD31陽性的細胞進行培養。

1.4.4 細胞生長觀察：取分選CD31陽性的血管瘤內皮細胞進行消化，消化完成后，加入含20%胎牛血清培養液終止消化，輕輕吹打漩渦混勻后制成細胞懸液，制成單細胞懸液（1×105個/ml），接種于24孔板中，500μl/孔，再于每孔中加入1ml完全內皮細胞培養液，輕輕搖晃24孔板使細胞分散均勻，置培養箱中繼續培養；設3個復孔，每隔1天隨機選擇3孔消化吹打并計數，取3孔平均值，以時間（d）為橫軸，細胞數（1×104個/ml）為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.4.5 免疫熒光鑒定：將分選后培養（三代）的內皮細胞接種于放有細胞爬片的6孔培養板中進行培養待細胞長至80%后取出細胞爬片，PBS液清洗2～3次，4%的多聚甲醛固定10min；PBS液洗3次/3min；1.5% H2O2 37℃孵育15min；10%山羊血清室溫，封閉30min；加入CD31單抗（1∶200）、VWF單抗（1∶500）避光，4℃過夜；PBS洗2～3遍/次，加入10%DAPI染細胞核；PBS液清洗后封片，免疫熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.4.6 流式細胞儀鑒定：將分選后培養（三代）的內皮細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，PBS液洗1～2遍/1min，1 000r/min離心10min，棄上清；計數板計數（5×105/ml）；加入CD31單抗（1∶100），室溫孵育30min；80%甲醇4℃固定5min；1 000r/min離心10min，棄上清；PBS液洗2～3遍/1min，1 000r/min離心10min，棄上清；加入1.5ml破膜劑，室溫，15min，1 000r/min離心10min，棄上清；10%山羊血清室溫封閉30min后，VWF單抗（1∶300），1 000r/min離心10min，PBS液500μl重懸細胞，送至流式細胞鑒定。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察：培養48～72h組織塊周圍可見游離出細胞（見圖1A），呈梭形、多邊形，細胞核清晰；72h后去除組織，2周左右可見部分形成“血管腔樣”結構（見圖1B），20d左右瓶底鋪滿80%以上傳代（見圖1C）。

注：A.嬰幼兒血管瘤內皮細胞從組織塊爬出（3d）；B.嬰幼兒血管瘤內皮細胞部分有形成“血管腔樣結構”（14d）；C.原代嬰幼兒血管瘤（2代）

圖1 細胞形態學觀察圖（40×）

2.2 流式細胞分選：可見明顯CD31陽性峰（見圖2）。

圖2 CD31 陽性分選

2.3 細胞生長曲線圖：分選后細胞24h內無明顯生長，48h開始增殖（3.58±0.1）×104個/孔，4～9d細胞分裂增殖加速（13.97±0.4）×104個/ 孔，逐漸進入對數生長期，10d以后進入平臺期（16.75±0.05）×104個/孔，細胞計數無明顯增加，此時，細胞生長穩定（見圖3）。隔天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并記錄細胞數目，以時間為橫軸，細胞數目為縱軸，繪制生長曲線。

圖3 細胞生長曲線

2.4 免疫熒光鑒定：VWF可見陽性呈綠色熒光細胞（見圖4A）；CD31陽性表達呈紅色表達（見圖4B）；VWF/CD31雙陽為黃綠色，藍色為細胞核（見圖4C）。

注：A.VWF陽性表達；B.CD31陽性表達；C.VWF/CD31陽性表達

圖4 免疫熒光鑒定圖（100×）

2.5 流式細胞鑒定：CD31單陽性率達98.4%，CD31、VWF雙陽性率90.3%見（見圖5）。

注：A.空白（Q3陰性對照）；B.Q1為CD31陽性表達；C.Q2為CD31/VWF共表達；D.P2為CD31陰性區；E.P3為CD31陽性區

圖5 流式細胞鑒定圖

3 討論

目前，對嬰幼兒血管瘤的增殖和消退的確切機制尚不清楚[7-9]，組織病理學證實血管瘤是以血管內皮細胞增生為主與成纖維細胞、周細胞、脂肪細胞等多種細胞構成的良性腫瘤。從細胞水平、生物分子水平研究嬰幼兒血管瘤的發病機制，需要有高效的方法分離獲得高純度的內皮細胞。本次實驗采用的組織法與消化結合法，經流式細胞儀分選再培養可得到較高純度的內皮細胞，有效去除組織中雜細胞，并通過細胞形態，細胞表面標記物免疫熒光鑒定，細胞表面標記物流式細胞鑒定為血管瘤內皮細胞。

培養原代細胞方法主要有消化法和組織塊法[10-11]，消化法容易獲得細胞但是血管瘤內皮細胞和雜細胞混合在一起不宜純化；組織塊法可得到純度高的細胞易于純化，但是得到細胞數量較少，細胞游出時間長，采用消化法和組織塊法結合可取得較好的效果[12]。然而，在血管瘤內皮細胞培養過程中最關鍵的就是去除雜細胞對細胞進行分離、純化。常用的分離純化的方法有磁珠分選法[13-14]、流式分選法、酶消化法、機械刮除法[15]、差速貼壁法[16]等，機械刮除法和相差速貼壁法因過程較復雜目前較少用。流式細胞分選可得到較高純度的細胞而且用時較短，可用三個字形容“快、精、準”，操作便捷、流程少、減少污染幾率。流式分選與磁珠分選相比純度及精確度更高。故本次研究采取消化法與組織塊法結合，流式分選后經嬰幼兒血管瘤內皮細胞表面標志物CD31鑒定純度可達98.4%，CD31與VWF雙陽率達90.3%。

流式分選使用時應注意幾點要求：細胞的數量不低于1×106個/ml、抗體孵育時間30～60min、抗體要與細胞數量有一定的比例。但是由于代價較高、分選環境（相對無菌間）較高、細胞數量較多，故多在做分子、基因等對細胞純度和數量有較高要求時，才選用此方法。然而，目前國內外對血管瘤的研究早已不再局限于細胞水平，已逐步拓展至分子、基因的層次。因此，傳統的組織塊法、消化法、組織塊與消化法結合培養方法已不能滿足研究需要，傳統的內皮細胞培養方法與流式分選技術的結合，勢在必行。

總之，本研究提供的嬰幼兒血管瘤內皮細胞來源，使大家不僅能從細胞水平上研究嬰幼兒血管瘤發病機制，而且在基因分子水平上進一步研究。另外聯合組織塊法、消化結合法和流式細胞分選技術進行原代血管瘤血管內皮細胞體外分離和純化，操作過程簡單、易行，可得到較高純度的細胞，對下一步研究血管瘤內皮細胞生物學特性十分有利。

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