TGF—β1調控ERK/MAPK信號通路對人牙髓細胞增殖和分化能力的影響研究

徐萬田 陳韻 林楠 唐玉香 閆翔

[摘要]目的：研究TGF-β1對牙髓細胞增殖、分化和ERK/MAPK信號通路的影響。方法：采用Western blot檢測TGF-β1在急性牙髓組織、慢性牙髓組織和正常牙髓組織中的表達，然后采用Ⅰ型膠原酶消化分離培養牙髓細胞，不同濃度的TGF-β1處理牙髓細胞7d，CCK-8法檢測細胞增殖。采用TGF-β1（5.0μg/L）和U0126（10μmol/L）分別單獨或聯合作用于牙髓細胞7d，CKK-8法檢測細胞增殖；在第1、3、5和7天檢測堿性磷酸化酶活性；第7天時Western blot檢測ERK/MAPK信號通路中的關鍵蛋白PPAR-γ和ELK-1水平。結果：TGF-β1在牙髓炎組織中低表達，且TGF-β1濃度在0.1～5.0?g/L時，從作用第3天開始能夠顯著促進牙髓細胞的增殖（P<0.05），具有時間和劑量依賴效應。U0126能夠抑制牙髓細胞的增殖和堿性磷酸化酶的活性，具有時間依賴性。TGF-β1能夠促進PPAR-γ和ELK-1蛋白的表達，而U0126能夠降低TGF-β1對PPAR-γ和ELK-1蛋白表達的促進作用。結論：TGF-β1可以促進牙髓細胞的增殖和分化，且具有時間和濃度依賴效應，其作用機制可能與ERK/MAPK信號通路相關。

[關鍵詞]牙髓細胞；增殖；分化；堿性磷酸化酶；信號通路

[中圖分類號]R781.3 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）04-0094-04

Effect of TGF-β1 on the Proliferation and Differentiation of Human Dental Pulp Cell Based on ERK/MAPK Signaling Pathway

XU Wan-tian，CHEN Yun，LIN Nan，TANG Yu-xiang，YAN Xiang

（The Third Clinic Department，Nanjing Stomatological Hospital Medical School of Nanjing University，Nanjing 210008，Jiangsu，China）

Abstract： Objective To study the effects of TGF-β1 on the proliferation， differentiation and ERK/MAPK signaling pathway of human dental pulp cells. Methods We used Western blot to detect TGF-β1 expression in acute and chronic dental pulp tissue organization and normal dental pulp tissue. Primary human dental pulp cells were isolated and cultured by typeⅠcollagenase digestion. Human dental pulp cells were treated by different concentrations of TGF-β1 for 7d. Used CCK-8 method to detect cell proliferation. Human dental pulp cells were treated by TGF-β1 （5.0μg/L） and U0126 （10μmol/L） separately or jointly for 7d and cell proliferation was detected by CKK-8 method. The activity of alkaline phosphorylase was detected in 1d， 3d， 5d and 7d. The levels of key proteins PPAR-γ and ELK-1 in the ERK/MAPK signaling pathway were detected by Western blot. Results TGF-β1 was low expression in the pulpitis tissue， and TGF-β1 concentration at 0.1-5.0μg/L， the proliferation of pulp cells was significantly promoted from the first 3d beginning （P<0.05）， with time and dose dependent effects. U0126 could inhibit the proliferation of pulp cells and the activity of alkaline phosphorylase， which had time dependence. TGF-β1 could promote the expression of PPAR-γ and ELK-1， while U0126 could reduce the promoter action of TGF-β1 on PPAR-γ and ELK-1 protein expression. Conclusion TGF-β1 could promote the proliferation and differentiation of pulp cells， and had time and concentration dependence effect， and its mechanism might be related to ERK/MAPK signaling pathway.

Key words： pulp cells； proliferation； differentiation； alkaline phosphorylase； signaling pathway

研究表明牙髓組織中含有自我增殖和分化的間充質干細胞，當牙髓復合體受到損傷后，牙髓細胞就會向受損部位遷移完成對牙本質的修復和保護[1]。但其調控機制尚不清楚。轉化生長因子β1（Transforming growth factor β1， TGF-β1）作為調控牙髓細胞遷移重要因子，參與到了反應性牙本質的修復[2]，有報道[3]稱其可以通過p38 MAPK信號調控抑制牙髓細胞增殖。研究表明胞外信號調節激酶/分裂原激活蛋白激酶信號通路（Extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK）能夠介導多種細胞的增殖和遷移[4]，而TGF-β1是否能夠基于ERK/MAPK信號通路對牙髓細胞增殖和分化進行調控尚未見報道。堿性磷酸化酶（Alkaline phosphorylase， ALP）是一種正磷酸甲酯磷酸水解酶，研究表明其水平高低可以反映牙髓細胞的分化情況[5]。因此本文主要探討ERK/MAPK信號通路在TGF-β1調控牙髓細胞增殖以及分化中的作用，從而為牙髓組織修復提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 一般資料：選取南京大學醫學院附屬口腔醫院保存的急性牙髓炎組織標本、慢性牙髓炎組織標本和正常牙髓組織標本各30例作為研究對象。

1.2 主要儀器和試劑：TGF-β1、ERK/MAPK信號通路阻斷劑U0126，采購自Peprotech公司。兔抗PPAR-γ、 ELK-1單克隆抗體自美國Abcam公司采購，酶標儀和流式細胞儀均采購自Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Western blot檢測TGF-β1在牙髓組織中的表達：急性牙髓組織、慢性牙髓組織和正常牙髓組織中蛋白各取100g，裂解蛋白酶進行總蛋白提取。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，調整濃度，上樣進行電泳，結束后4℃轉膜，5% BSA封閉2h，加入一抗（羊抗TGF-β1單克隆抗體）、二抗（羊抗鼠IgG）37℃孵育2h，ECL顯影后掃描，蛋白相對表達量經內參校正后經Quanity-One軟件分析，β-actin作為內參。

1.3.2 人牙髓組織體外培養和傳代：征得患者同意后，取在南京大學醫學院附屬口腔醫院就診年齡18～25歲的因阻生或正畸而拔出的健康牙齒，乙醇消毒，在超凈臺中取出牙髓組織，然后PBS沖洗，放置于DMEM溶液中并剪成1～2mm3的組織塊，加入Ⅰ型膠原酶消化40min，然后低速離心棄上清液，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養液，接種于培養瓶中，37℃、5% CO2培養箱中培養，每隔2d更換一次培養液，細胞鋪滿瓶底80%左右，加入胰酶進行消化傳代，本研究采用第4～5代細胞進行研究。

1.3.3 CCK-8法檢測TGF-β1對牙髓細胞增殖能力的影響：取傳代一致的牙髓細胞，調整細胞濃度至1×105接種于96孔板中，每孔200μl，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基培養24h后，更換無血清DMEM培養基進行饑餓處理24h，然后分別更換成含TGF-β1終濃度為0.1、0.5、2.0、5.0μg/L的DMEM培養基，同時設置只加DMEM的對照組，每隔2d更換一次培養基。然后在培養1、3、5和7d時，每孔加入10μl CCK-8溶液，繼續培養4h，酶標儀檢測各組OD值。

1.3.4 ERK/MAPK信號通路在TGF-β1調控牙髓細胞增殖過程中的作用：實驗步驟同1.3.3，共分為4組：①對照組；②TGF-β1（5.0μg/L）處理組；③TGF-β1（5.0μg/L）+U0126（10μmol/L）處理組；④U0126（10μmol/L）處理組。

1.3.5 Western blot檢測PPAR-γ、ELK-1蛋白表達：按照1.3.4各組處理培養7d，提取蛋白，按照1.3.1步驟對PPAR-γ、ELK-1蛋白進行檢測。

1.3.6 堿性磷酸化酶水平檢測：取傳代一致的牙髓細胞，調整細胞濃度至1×105接種于96孔板中，每孔200μl，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基培養24h后，更換無血清的DMEM培養基進行饑餓處理24h，然后按照1.3.5分組替換含TGF-β1或U0126的培養基，分別在培養的1d、3d、5d和7d時，棄去細胞培養基，加入50μl 1g/L的TrionX-100，4℃過夜，然后每孔加入200μl ALP底物，37℃、5%CO2培養箱中培養30min，加入堿液終止反應，酶標儀檢測OD值。

1.3.7 統計學分析：數據分析采用SPSS 16.0軟件，繪圖采用GraphPad Prism 5.0軟件，計量資料采用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β1在各牙髓組織中的表達比較：如圖1所示，TGF-β1在急性牙髓炎組織和慢性牙髓炎組織中的表達顯著低于正常牙髓組織，差異有統計學意義（P<0.05）。

注：A.正常牙髓組織；B.急性牙髓炎組織；C.慢性牙髓炎組織；*表示與正常牙髓組織比較，P<0.05

圖1 TGF-β1在各牙髓組織中的表達

2.2 TGF-β1對牙髓組織增殖的影響：如圖2所示，在培養第3、5和7天，0.5、2.0、5.0μg/L TGF-β1組細胞中的OD490值均顯著高于對照組（P<0.05），且OD490值隨著TGF-β1濃度的增加而不斷升高。同一濃度下與第1天比較，OD490值在第3、5和7天均顯著升高（P<0.05）。本次后續研究選用TGF-β1濃度為5.0μg/L。

注：*表示與對照組比較，P<0.05；△表示與第1天比較，P<0.05

圖2 TGF-β1對牙髓組織增殖的影響

2.3 ERK/MAPK信號通路在TGF-β1調控牙髓細胞增殖的影響：如圖3所示，牙髓細胞培養第3、5和7天，TGF-β1組細胞的OD490值顯著高于對照組（P<0.05）；而TGF-β1+U0126組和U0126組的OD490值顯著低于對照組和TGF-β1組（P<0.05）。

注：*表示與對照組比較，P<0.05；△表示與TGF-β1組比較，P<0.05

圖3 ERK/MAPK信號通路在TGF-β1調控牙髓細胞增殖的影響

2.4 ERK/MAPK信號通路在TGF-β1調控牙髓細胞分化的影響：如圖4所示，牙髓細胞培養第3、5和7天，TGF-β1組細胞ALP活性顯著高于對照組（P<0.05），且隨著時間的增加，活性逐漸增高。而TGF-β1+U0126組和U0126組的細胞ALP活性顯著低于對照組和TGF-β1組（P<0.05）。

注：*表示與對照組比較，P<0.05；△表示與TGF-β1組比較，P<0.05

圖4 ERK/MAPK信號通路在TGF-β1調控牙髓細胞分化的影響

2.5 TGF-β1調控牙髓細胞增殖和分化中對PPAR-γ、 ELK-1蛋白表達的影響：如圖5所示，TGF-β1組PPAR-γ和ELK-1蛋白表達顯著高于對照組（P<0.05）；而TGF-β1+U0126組和U0126組的PPAR-γ和ELK-1蛋白表達水平顯著低于對照組和TGF-β1組（P<0.05）。提示U0126能夠降低TGF-β1對PPAR-γ和ELK-1蛋白表達的促進作用。

注：A.對照組；B.TGF-β1組；C.TGF-β1+UO126組；D.UO126組；*表示與對照組比較，P<0.05；△表示與TGF-β1組比較，P<0.05

圖5 TGF-β1調控牙髓細胞增殖和分化中對PPAR-γ、ELK-1蛋白表達的影響

3 討論

牙髓組織作為一種有礦化組織包繞的疏松結締組織，在牙本質形成、咀嚼和防御方面起著重要的作用，因此其健康與否直接關系到牙齒的形態和功能[6-7]。牙髓受損后，其治療立足于保存患牙，但是死髓牙要想進行正常的咀嚼功能，仍需要大量的后續修復治療。因此保存活牙髓，對牙髓復合體組織進行誘導再生，已成為目前口腔科研工作者不斷探尋的課題。

近年來研究表明生長因子和牙本質基質成分可以作為始動信號對牙髓進行修復，相關的生長因子譬如骨形成蛋白（Bone morphogenesis proteins， BMPs）、TGF-β1、胰島素樣生長因子等這些都可以在牙本質細胞和牙髓細胞中檢測到[3，8-9]。其中TGF-β1研究證實其是細胞增殖、分化和凋亡最重要的調控因子。本研究結果顯示TGF-β1在牙髓炎組織中的表達出現下降，隨著TGF-β1濃度的升高，處理時間越長，細胞增殖越快。ERK/MAPK作為細胞中重要的信號通路，參與調控細胞增殖、遷移、分化等多種生理過程當中，有文獻報道稱ERK/MAPK信號通路可以增強牙髓干細胞的增殖和分化[10]。U0126是ERK/MAPK信號通路特異性抑制劑[11]，本研究通過將TGF-β1和U0126分別單獨或聯合作用于牙髓細胞，結果顯示U0126能夠抑制TGF-β1對牙髓細胞的增殖作用。本研究還發現TGF-β1能夠促進ERK/MAPK信號通路中的關鍵蛋白PPAR-γ、 ELK-1的表達，提示ERK/MAPK信號通路參與到了TGF-β1誘導的牙髓細胞增殖過程。ALP作為一種正磷酸甲酯磷酸水解酶，其活性的高低可以對細胞的礦化和骨組織形成的狀況。在牙髓組織中常將其作為牙髓細胞想牙本質細胞分化的早期標志。本研究結果顯示TGF-β1可以顯著增加ALP的活性，而U0126降低ALP的活性。

綜上所述，TGF-β1可以促進牙髓細胞的增殖和分化，且具有時間和濃度依賴性，其作用機制可能與ERK/MAPK信號通路相關，本研究為牙髓組織修復再生奠定了基礎。

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