miRNA—769—5p上調對正常人成纖維細胞生物活性的影響

倪娜 周炳榮 馬委委 駱丹

[摘要]目的：探討上調miRNA-769-5p表達對正常人成纖維細胞生物活性的影響。方法：將miRNA-769-5p mimics轉染至人成纖維細胞中，CCK-8試劑盒測定細胞增殖率，熒光顯微鏡下觀察氧化損傷熒光，流式細胞儀測定熒光值與細胞凋亡率，將通過轉染miRNA-769-5p mimics上調miRNA-769-5p表達的轉染組與未經處理的對照組成纖維細胞進行比較。結果：轉染組miRNA-769-5p相對表達量為（1.36±0.2）顯著高于對照組的（1.0±0.1），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；轉染組細胞增值率為（0.747±0.072）明顯低于對照組的（1.007±0.025），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；轉染組細胞熒光值（92.067±3.092）明顯高于對照組的（21.600±8.487），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；轉染組細胞凋亡率為（49.299±5.184）%明顯高于對照組的（5.977±0.939）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：上調miRNA-769-5p可誘導出類似紫外線光損傷效應，對正常人成纖維細胞生物活性產生影響。

[關鍵詞]miRNA；成纖維細胞；紫外線；光損傷

[中圖分類號]R329.2+8 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）04-0109-03

Effect of miRNA-769-5p on Biological Activity of Normal Human Fibroblasts

NI Na，ZHOU Bing-rong，MA Wei-wei，LUO Dan

（Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China）

Abstract： Objective To investigate the effect of miRNA-769-5p on biological activity in normal human fibroblasts. Methods Human fibroblasts were transfected with miRNA-769-5p mimic. CCK-8 kit was performed to test proliferation rate. Cell were observed under fluorescence microscope. Flow cytometer was used to measured rate of reactive oxygen species and apoptosis. All the parameters of the mimics group were compared with the control group. Results The relative expression of miRNA-769-5p in the mimics group was （1.36±0.2）， which was significantly higher than that of the control group （1.0±0.1）， the difference was statistically significant（P<0.05）. The cell proliferation rate in the mimics group （0.747±0.072） was significantly lower than that of the control group （1.007±0.025）（P<0.05）. The fluorescence value of the mimics group （92.067±3.092） was significantly higher than that of the control group （21.600±8.487）（P<0.05）. The apoptotic rate in the mimics group was （49.299 ± 5.184）%， which was significantly higher than that of the control group （5.977±0.939）%（P<0.05）. Conclusion Up-regulation of miRNA-769-5p induce photo-damage and have effect on biological activity in normal human fibroblasts.

Key words： miRNA； fibroblasts； ultraviolet； photodamage

紫外線是自然界廣泛傳播的一種輻射來源，研究者將其定義為一種波長為180～400nm的非電離輻射。根據(jù)波長，可將紫外線分為短波紫外線UVC（200～280nm）、中波紫外線UVB（280～320nm）和長波紫外線UVA（320～400nm）。其中短波紫外線穿透能力最弱，日光中含有的短波紫外線幾乎完全被臭氧層吸收。紫外線輻射可造成被輻射細胞出現(xiàn)光損傷，表現(xiàn)為多種生物學指標異常。研究發(fā)現(xiàn)，除了直接受輻射的細胞，未被輻射的臨近細胞甚至遠隔細胞也可能出現(xiàn)類似的光損傷現(xiàn)象，這種現(xiàn)象被稱之為“旁觀者效應”[1]。在前期實驗中，通過對光損傷后差異性表達的miRNA進行基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)miRNA-769-5p在光損傷中可能起到一定作用。過去的研究顯示，miRNA-769-5p可以調控部分生物進程。在本次研究中，通過對正常人成纖維細胞轉染外源性miRNA-769-5p，觀察其對正常成纖維細胞生物活性產生的影響。

1 材料和方法

1.1 材料：成纖維細胞取自于健康成年男性包皮組織。DMEM培養(yǎng)液購于美國Hyclone公司，小牛血清購于杭州四季青公司，Trizol核算提取液購于美國Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司，DCFH氧化損傷試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，miRNA轉染試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司，UVA、UVB照射儀購于上海希格瑪高技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分離與培養(yǎng)：獲得包皮后，用含青-鏈霉素的PBS反復沖洗3次至無肉眼可見血跡，剪去包皮皮下組織，將其剪成約0.5cm×0.5cm大小皮片，PBS沖洗3次后棄PBS，加入分散酶，放入4℃冰箱中消化18～20h后將表皮和真皮分離。取真皮部分，加入膠原酶消化液，放入37℃細胞培養(yǎng)箱中消化2h，取出后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，吹打過濾后離心，之后棄細胞上清液，加入含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，轉移至培養(yǎng)皿中，放入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染與分組：成纖維細胞接種于實驗所需相應培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后貼壁，在0℃中使用轉染緩沖液與轉染試劑混合，稀釋其至50nm，冰上放置10min。去除細胞上清液，加入混合轉染液后放入37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。使用聚合鏈式酶反應檢測轉染效果，轉染成功后進行下一步檢測。將轉染miRNA-769-5p mimics的成纖維細胞稱為轉染組，未進行轉染的正常人成纖維細胞稱為對照組。

1.2.3 細胞增值率測定：將細胞以每2 000/100μl密度均勻種植在96孔板中，去除細胞上清后，每孔避光加入10μl CCK-8溶液及100μl培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中避光孵育2h，使用酶標儀測定在450nm處的吸光度值。

1.2.4 氧化損傷檢測：將細胞以每2 000/100μl的密度均勻種植在6孔板中，按照1：1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA使終濃度為10μmol/L，去除細胞培養(yǎng)液，每孔加入稀釋好的DCFH-DA 1ml，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次后在鏡下觀察熒光強度。加入胰酶后，消化下的細胞在流式細胞儀下檢測熒光值。

1.2.5 細胞凋亡測定：將細胞以每2 000/100μl的密度均勻種植在6孔板中，去除細胞上清，PBS洗滌后，使用胰酶消化貼壁細胞，將細胞懸液放入離心機中1 000g離心5min，棄上清，收集細胞，PBS重懸后，轉移至離心管1 000g離心5min棄上清，使用AnnexinV-FIFC重懸細胞，加入5?l AnnexinV-FIFC及10?l碘化丙啶染色液混勻，室溫避光孵育10～20min后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 17.0軟件進行版本，檢測數(shù)據(jù)均以（x?±s）表示，采用t檢驗，P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-769-5p mimics轉染上調miRNA-769-5p的表達：轉染組miRNA-769-5p相對表達量為（1.36±0.2）顯著高于對照組的（1.0±0.1），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 上調miRNA-769-5p對細胞增殖率的影響：使用CCK-8試劑盒在酶標儀下測細胞增殖率，轉染組細胞增值率為（0.747±0.072）明顯低于對照組的（1.007±0.025），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 上調miRNA-769-5p對細胞氧化損傷的影響：使用活性氧檢測試劑盒觀察、測定細胞氧化損傷情況，激光共聚焦顯微鏡下，轉染組大部分細胞出現(xiàn)熒光染色陽性，對照組在熒光顯微鏡下無明顯熒光。經流式細胞儀檢測，轉染組細胞熒光值（92.067±3.092）明顯高于對照組的（21.600±8.487），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖3～4。

2.4 上調miRNA-769-5p對細胞凋亡率的影響：轉染組細胞凋亡率為（49.299±5.184）%明顯高于對照組的（5.977±0.939）%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖5。

3 討論

紫外線照射可以造成被輻射細胞發(fā)生不同程度的光損傷[2]，在成纖維細胞中，細胞發(fā)生的變化包括基因表達的改變、細胞增殖異常、氧化損傷、凋亡等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，旁觀者效應可以發(fā)生在電離或者非電離輻射中，除了直接輻射的部分，同一個體臨近的未被輻射的部分也會發(fā)生類似輻射后的反應。體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，通過將輻射后細胞培養(yǎng)上清液轉移至正常未輻射細胞，類似的損傷現(xiàn)象同樣可以發(fā)生在未經紫外線輻射的細胞中[4]。

miRNAs是一組調控蛋白質基因表達的非編碼RNA，它可以通過結合到mRNAs而進行負向調控。通過這種途徑，miRNAs在許多生物進程中起到了至關重要的作用[5]。細胞內的miRNAs被囊泡包裹后可以釋放到細胞外環(huán)境，免于被各種酶消化而穩(wěn)定存在，這種包裹在囊泡中的miRNAs被稱為分泌型miRNAs[6]。目前有些研究認為在光損傷中，分泌型miRNAs可能通過被釋放至細胞外環(huán)境從而在被輻射細胞與旁觀者細胞之間的信號通路中起到調控作用[7]，臨床研究也證明在多種疾病中，內含miRNAs的外泌體的含量可發(fā)生一定的改變[8]。

mimics是一種運用化學方法合成的生物體內源性miRNA模擬體，能夠起到增強內源性miRNA功能的作用。本次選擇使用miRNA mimics轉染引起內源性成熟miRNA的高表達，以增強內源性miRNA的調控作用。CCK-8目前已被廣泛用于細胞增殖試驗中。活性氧簇為需氧細胞在代謝過程中產生，但中、高濃度ROS通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死。

前期實驗中發(fā)現(xiàn)，顯微鏡下觀察直接由受輻射細胞上清液共同孵育的旁觀者細胞出現(xiàn)了明顯的形態(tài)改變，如過度伸展、排列疏松、出現(xiàn)細胞碎片等。還會出現(xiàn)細胞增殖率降低、氧化損傷及凋亡率升高等，這些都是細胞出現(xiàn)光損傷的實驗室表現(xiàn)。本次實驗中選擇使用miRNA mimics對miRNA-769-5p進行表達上調，研究其對正常人成纖維細胞生物活性的影響。將正常人成纖維細胞轉染miRNA-769-5pmimics，導致miRNA-769-5p表達上調后，可出現(xiàn)細胞增殖率下降、氧化損傷增加以及凋亡率增加等現(xiàn)象。這些結果均表明miRNA-769-5p可以誘導出類似紫外線光損傷效應，這可能是急性中長波紫外線輻射后光損傷機制之一。

有研究表明，miRNA-769-5p在細胞增殖、分化、凋亡的生物進程中發(fā)揮著一定作用[9]，如部分肺腺癌患者體內的miRNA-769-5p可發(fā)生顯著失調，炎癥性腸病的患者血液中的miRNA-769-5p也會發(fā)生變化[10]，Sebastien發(fā)現(xiàn)miRNA-769-5p在神經退行性疾病中出現(xiàn)了陽性信號。除此之外，miRNA-769-5p也可以通過調控下游的因子，如ARID1A以及GSK3B來調控細胞增殖[11-12]。

本次研究著重探討了miRNA-769-5p對成纖維細胞生物學活性的影響，通過增加外源性miRNA-769-5p的表達，產生了類似光損傷后的生物學指標變化。但本文并未詳細闡述miRNA-769-5p在旁觀者效應中的具體作用，這有待于后續(xù)進一步探討。除了miRNA-769-5p外，也有其他miRNAs在紫外線光損傷進程中發(fā)揮著調控作用。隨著研究的深入，希望能發(fā)現(xiàn)更多與紫外線光損傷有關的miRNAs及其相關作用機制，為今后光老化的預防與治療提供新的思路與線索。

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