甲基蓮心堿在氧化應激中的作用機制研究

劉向東，李慧，王成志，趙煥東，肖平

（1.中南大學湘雅醫(yī)院 腎內科，湖南 長沙 410008；2.湖南省長沙市第一醫(yī)院 呼吸科，湖南 長沙 410005；3.中南大學湘雅醫(yī)院 衛(wèi)生部納米生物技術重點實驗室，湖南 長沙 410007）

甲基蓮心堿（Neferine, Nef）是從蓮子心中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿[1-2]。研究表明，其具有抗癌﹑抗血栓形成﹑減輕急性腎損傷﹑抑制炎癥和氧化應激等生物學作用[1-7]。但對于Nef在糖尿病腎病中的作用及機制尚不清楚。本研究以高糖培養(yǎng)大鼠近端腎小管上皮細胞（normal rat kidney proximal tubular epithelial cell, NRK-52E）復制糖尿病體外細胞實驗模型[8-9]。采用Nef進行干預，觀察細胞活力﹑血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1, HO-1）和氧化應激指標的變化，探究Nef在糖尿病腎病中的作用及其機制。見圖 1﹑2。

圖1 Nef化學結構式

圖2 NRK-52E細胞 （×100）

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

NRK-52E細胞株（中國科學院上海細胞庫），DMEM細胞培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（中國杭州四季青生物工程材料有限公司），Nef（中國大連美侖生物技術有限公司），D-無水葡萄糖（中國北京索萊寶科技有限公司），鋅原卟啉Ⅸ（zinc protoporphyrin Ⅸ, ZnP）和甘露醇購自美國Sigma公司，HO-1抗體和P67抗體購自美國Abcam公司，β-actin抗體（美國Cell Signaling Technology公司），CCK-8（日本同仁化學研究所），總膽紅素（total bilirubin,TB）﹑活性氧（reactive oxygen species, ROS）及丙二醛（malondialdehyde, MDA）測定試劑盒購自中國南京建成生物工程研究所。細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），酶標儀（美國Bio-Tek公司），電泳儀（美國BIORAD公司），Fluor Chem R多功能成像分析系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司），流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將NRK-52E細胞培養(yǎng)于含5%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，于37℃﹑5%二氧化碳CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1﹑2天更換培養(yǎng)基。細胞長滿瓶底約80%時，按1∶3～1∶5進行傳代，取對數期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞分組 實驗分為6組：①對照組，用正常葡萄糖濃度（5.5 mmol/L）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，不予特殊處理；②高滲組，在對照組中加入38.9 mmol/L甘露醇，作為滲透壓對照[8]；③高糖組，加入無水葡萄糖使DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖濃度達44.4 mmol/L，作為糖尿病腎病體外細胞實驗模型[8-9]；④Nef組，在高糖組中加入2μmol/L Nef；⑤HO-1抑制劑組，在Nef組中加入10μmol/L HO-1特異性酶活性抑制劑ZnP；⑥ZnP組：對照組中加入10μmol/L ZnP。上述各組干預時間均為24 h。

1.2.3 CCK-8法 采用CCK-8法檢測細胞活力。取對數期NRK-52E細胞種植于96孔板，細胞密度2 000個/孔，培養(yǎng)12 h后進行換液，加入含不同處理組藥物的培基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再加入10μl CCK-8試劑于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，最后使用酶標儀檢測各孔450 nm處吸光度。上述實驗獨立重復≥3次。

1.2.4 Western blot檢測 采用 Western blot檢測HO-1和P67的表達。使用RIPA細胞裂解液裂解各組細胞，收集蛋白樣品。使用10% SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，再將蛋白質電轉移（250 mA，2 h）至0.45μm孔徑的PVDF膜；用含5%胎牛血清白蛋白的TBST封閉2 h；隨后于4℃孵育一抗過夜（HO-1比例1∶20 000，P67和β-actin比例1∶2 000）。用TBST洗膜3次，10min/次，加入二抗于室溫孵育1 h；TBST洗膜洗膜3次，10min/次，最后使用超敏ECL化學發(fā)光劑顯影，用Alpha-View軟件進行灰度值分析。

1.2.5 DCFH-DA探針 采用DCFH-DA探針檢測ROS。取對數期細胞接種于6孔板，培養(yǎng)穩(wěn)定12 h后換液，加入含不同處理組藥物的培基繼續(xù)培養(yǎng)21 h，再加入8μmol/L DCFH于37℃孵育3 h，棄培養(yǎng)液，預冷PBS漂洗2遍，加入無EDTA的胰酶消化后收集細胞，預冷PBS再次漂洗2遍，加入PBS重懸（細胞密度10×106個/ml），最后使用流式細胞儀檢測細胞內熒光信號（激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525 nm），采用Flowjo 7.6軟件進行結果分析[10-12]。實驗獨立重復3次。

1.2.6 TB和MDA的檢測 細胞接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)穩(wěn)定12 h后換液，加入含不同處理組藥物的培基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，按照檢測試劑盒說明書分別定量檢測TB和MDA，并使用細胞總蛋白進行標準化（nmol/mg）。

1.3 統(tǒng)計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Nef對高糖培養(yǎng)的NRK-52E細胞活力的影響

對照組﹑ZnP組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組的細胞活力分別為（100.00±8.33）%﹑（84.18±6.64）%﹑（91.30±10.62）%﹑（73.88±7.82）%﹑（108.16±12.12）%和（84.26±11.57）%，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=10.837，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，ZnP組﹑高滲組的細胞活力與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高糖組細胞活力低于對照組和Nef組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組細胞活力低于Nef組（P＜0.05）。

對照組NRK-52E細胞活力為（100.00±10.71）%，0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0﹑4.0﹑6.0﹑8.0 和 16.0μmol/L Nef組 的 細 胞 活 力 分 別 為（76.67±9.99）%﹑（81.11±7.68）%﹑（90.11±7.41）%﹑（103.81±15.81）%﹑（114.08±10.19）%﹑（116.21±5.59）%﹑（94.30±7.11）%和（53.16±7.29）%，經方差分析,差異有統(tǒng)計學意義（F=17.333，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，0.0μmol/L Nef組細胞活力低于對照組（P＜0.05）；16.0μmol/L組細胞活力低于 0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）；2.0﹑4.0﹑6.0和 8.0μmol/L Nef組細胞活力均高于0.0μmol/L Nef組。見圖3。

2.2 Nef對HO-1和P67蛋白表達的影響

2.2.1 HO-1蛋白 對照組HO-1蛋白相對表達量為（1.00±0.00），0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0 和 4.0μmol/L Nef組HO-1蛋白相對表達量分別為（1.34±0.10）﹑（1.58±0.30）﹑（2.22±0.47）﹑（2.96±0.39）和（3.62±0.19），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=36.778，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，0.0μmol/L Nef組HO-1蛋白相對表達量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；1.0﹑2.0和 4.0μmol/L Nef組HO-1蛋白表達水平高于 0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）。見圖4。

圖3 不同濃度Nef對NRK-52E細胞活力的影響 （±s）

圖4 不同濃度Nef對HO-1和P67蛋白表達的影響

2.2.2 P67蛋白 對照組P67蛋白相對表達量為（1.00±0.00），0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0 和 4.0μmol/L Nef組P67蛋白相對表達量分別為（2.02±0.21）﹑（1.70±0.13）﹑（1.56±0.08）﹑（1.31±0.09） 和（1.16±0.15），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=25.728，P=0.000）（見圖4）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，0.0μmol/L Nef組P67蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05）；0.5﹑1.0﹑2.0和4.0μmol/L Nef組P67蛋白表達水平低于0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）。對照組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組﹑ZnP組的P67蛋白相對表達量分別為（1.00±0.00）﹑（1.08±0.17）﹑（1.75±0.15）﹑（1.32±0.22）﹑（1.98±0.13）和（1.19±0.03），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=23.629，P=0.000）（見圖 5）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，高糖組P67蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05）；Nef組P67蛋白表達水平低于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組P67蛋白表達水平高于 Nef組（P＜0.05）。

2.3 Nef對HO-1酶活性的影響

對照組﹑ZnP組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組的HO-1酶活性分別為（0.75±0.13）﹑（0.57±0.10）﹑（0.87±0.17）﹑（1.07±0.11）﹑（2.90±0.29）和（0.66±0.12）nmol/mg，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=86.536，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，高糖組HO-1酶活性高于對照組（P＜0.05）；Nef組HO-1酶活性高于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組HO-1酶活性低于Nef組（P＜0.05）。

對照組HO-1酶活性（0.75±0.13）nmol/mg，0.0﹑0.5﹑1.0﹑2.0和 4.0μmol/L Nef組 的 HO-1酶 活 性分 別 為（1.07±0.11）﹑（1.46±0.20）﹑（2.03±0.24）﹑（2.90±0.29）和（3.52±0.35）nmol/mg，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=63.828，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，0.0μmol/L Nef組HO-1酶活性與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；1.0﹑2.0和4.0μmol/L Nef組的HO-1酶活性高于0.0μmol/L Nef組（P＜0.05）。見圖 6。

2.4 Nef對高糖培養(yǎng)的NRK-52E細胞ROS水平的影響

對照組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑制劑組﹑ZnP組的ROS分別為（1539.16±882.07）﹑（2564.16±1550.08）﹑（13342.50±1952.24）﹑（5077.83±611.45）﹑（16175.83±678.36）和（2248.16±1592.09），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=69.496，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，高糖組ROS水平高于對照組（P＜0.05）；Nef組ROS水平低于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組ROS水平高于Nef組（P＜0.05）。見圖 7。

2.5 Nef對MDA的影響

對照組﹑ZnP組﹑高滲組﹑高糖組﹑Nef組﹑HO-1抑 制 劑 組 的 MDA分 別 為（0.381±0.036）﹑（0.536±0.031）﹑（0.492±0.039）﹑（0.914±0.093）﹑（0.472±0.070） 和（1.038±0.088）nmol/mg， 經 方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=52.016，P=0.000）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，高糖組MDA水平高于對照組（P＜0.05）；Nef組MDA水平低于高糖組（P＜0.05）；HO-1抑制劑組MDA水平高于Nef組（P＜0.05）。

圖5 不同處理組P67蛋白表達水平比較

圖6 不同濃度Nef對 HO-1酶活性的影響 （±s）

圖7 不同處理組ROS的變化

3 討論

氧化應激在組織器官損傷和功能障礙中扮演重要角色[13]。過高的ROS可使細胞內蛋白質﹑脂質和核酸出現過氧化損傷，并引起細胞代謝障礙，最終導致細胞功能障礙，甚至出現壞死或凋亡[13-16]。在糖尿病中，NADPH氧化酶活性增加﹑線粒體功能障礙等導致ROS產生增多，而超氧化物歧化酶﹑過氧化氫酶﹑谷胱甘肽過氧化物酶功能下降又引起ROS清除障礙，最終導致ROS產生并積聚，使機體持續(xù)處于氧化應激狀態(tài)[14-15,17]。在糖尿病腎臟，ROS可直接損傷濾過屏障﹑足細胞﹑內皮細胞和腎小管上皮細胞，還可通過激活多元醇途徑和蛋白激酶C，促進糖基化產物形成及腎間質纖維化，最終導致糖尿病腎病[8，14，18]。目前臨床上常使用硫辛酸﹑維生素E等抗氧化劑進行抗氧化應激治療，但療效有限，因此尋找更安全有效的抗氧化應激藥物是當務之急[19]。

已知中藥蓮子心具有解熱﹑鎮(zhèn)痛﹑止血劑等功效。Nef是蓮子心的重要活性成分。以往研究表明，其具有抗癌﹑抗心律失常﹑抗血栓形成﹑抗纖維化﹑抗炎﹑抗氧化應激及抗凋亡等作用[1，6，20-21]。本研究利用高糖培養(yǎng)NRK-52E細胞，復制糖尿病腎病體外實驗模型[8]，通過檢測NADPH氧化酶﹑ROS﹑MDA及細胞活力，證實高糖可以誘導NRK-52E細胞出現氧化應激，導致細胞活力下降，并發(fā)現Nef可減輕上述氧化應激損傷。

NADPH氧化酶是產生ROS的主要酶，與腎臟氧化應激密切相關，由5個亞基組成：2個膜亞基gp91﹑p22組成膜復合體，3個胞質亞基p40﹑p47﹑p67[8]。本研究通過Western blot檢測P67亞基，反映NADPH氧化酶的表達和氧化應激。HO-1是血紅素代謝的關鍵酶，廣泛表達于全身各個組織器官，可將血紅素分解為一氧化碳CO﹑膽綠素和Fe2+，具有舒張血管﹑抗炎﹑抗氧化應激及抗凋亡等作用[22-23]。在腎臟，HO-1主要表達于近端腎小管上皮細胞，依次是遠端小管﹑集合管和髓袢，腎小球﹑足細胞和系膜細胞幾乎不表達，因此本實驗選擇NRK-52E細胞作為研究對象[24-25]。HO-1是一種蛋白酶，其抗氧化應激功能主要由其代謝產物膽紅素和CO產生，因此在實驗中常采用膽紅素的濃度來反映HO-1的酶活性[22，26]。HO-1抗氧化應激作用的強弱除與量有關，更與酶活性相關。本實驗使用的ZnP就是與HO-1酶活性中心特異性結合，從而抑制HO-1的功能，但其對HO-1的表達無抑制作用，甚至因為酶活性下降，導致底物堆積，反而促進HO-1的表達[27-28]。本研究通過檢測HO-1的表達和酶活性，并比較其在高糖組﹑Nef組和HO-1抑制劑組的變化，且同時檢測和比較該組P67的表達水平﹑細胞活力﹑ROS和MDA，結果發(fā)現Nef可以誘導HO-1的表達并增加酶活性，相應地使P67表達下調，ROS和MDA下降，細胞活力增加；當抑制HO-1活性后，Nef上述作用消失，由此說明Nef具有抗氧化應激作用，而且該作用是通過HO-1實現的。

綜上所述，本研究發(fā)現Nef通過誘導HO-1表達并增加酶活性，從而抑制NADPH氧化酶的表達，導致ROS減少，脂質過氧化減弱，氧化應激損傷減輕，從而保護細胞。不僅證實高糖可誘導氧化應激損傷，Nef具有抗氧化應激作用，并探究Nef抗氧化應激的部分機制，為臨床治療糖尿病腎病和氧化應激損傷提供新思路和實驗依據，也為Nef的后續(xù)實驗和臨床應用打下實驗基礎。但本研究尚局限于細胞水平，且氧化應激檢測指標有限，也只探究了Nef抗氧化應激作用與HO-1的關系，尚需從整體水平進一步驗證，并探究更多的Nef抗氧化應激機制。

參 考 文 獻：

[1]LI H, TANG Y, WEN L, et al. Neferine reduces cisplatin-induced nephrotoxicity by enhancing autophagy via the AMPK/mTOR signaling pathway[J]. Biochemical Biophysical Research Communications, 2017, 484(3): 694-701.

[2]BASKARAN R, POORNIMA P, HUANG C Y, et al. Neferine prevents NF-κB translocation and protects muscle cells from oxidative stress and apoptosis induced by hypoxia[J]. Biofactors,2016, 42(4): 407-417.

[3]GUAN G, HAN H, YANG Y, et al. Neferine prevented hyperglycemiainduced endothelial cell apoptosis through suppressing ROS/Akt/NF-κB signal[J]. Endocrine,2014,47(3):764-771.

[4]PRIYA L B, BASKARAN R, HUANG C Y, et al. Neferine ameliorates cardiomyoblast apoptosis induced by doxorubicin:possible role in modulating NADPH oxidase/ROS-mediated NF-κB redox signaling cascade[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 12283.

[5]EID W, ABDEL R W. Neferine enhances the antitumor effect of mitomycin-C in hela cells through the activation of p38-MAPK pathway[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2017, 118(10): 3472-3479.

[6]ZHENG L, CAO Y, LIU S, et al. Neferine inhibits angiotensin II-induced rat aortic smooth muscle cell proliferation predominantly by downregulating fractalkine gene expression[J]. Experimental Therapeutic Medicine, 2014, 8(5): 1545-1550.

[7]LI X, TONG G, ZHANG Y, et al. Neferine inhibits angiotensin II-stimulated proliferation in vascular smooth muscle cells through heme oxygenase-1[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2010, 31(6):679-686.

[8]PIWKOWSKA A, ROGACKA D, AUDZEYENKA I, et al. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes[J]. Journal of Cellular Biochemistry,2011, 112(6): 1661-1672.

[9]ZHANG X, LIU X, LI Y, et al. Downregulation of microRNA-155 ameliorates high glucose-induced endothelial injury by inhibiting NF-κB activation and promoting HO-1 and NO production[J].Biomedicine Pharmacotherapy, 2017, 88: 1227-1234.

[10]SUN Z, HU W, YIN S, et al. NGF protects against oxygen and glucose deprivation-induced oxidative stress and apoptosis by upregulation of HO-1 through MEK/ERK pathway[J]. Neuroscience Letters, 2017, 641: 8-14.

[11]JIA Z, DONG A, CHE H, et al. 17-DMAG protects against hypoxia-/reoxygenation-induced cell injury in HT22 cells through Akt/Nrf2/HO-1 pathway[J]. Dna Cell Biology, 2016, 36(2): 95-102.

[12]WANG Z, KA S O, LEE Y, et al. Butein induction of HO-1 by p38 MAPK/Nrf2 pathway in adipocytes attenuates high-fat diet induced adipose hypertrophy in mice[J]. European Journal of Pharmacology, 2017, 799: 201-210.

[13]PRUCHNIAK M P, ARAZNA M, DEMKOW U. Biochemistry of oxidative stress[J]. Oxygen Transport to Tissue XXXIII, 2015,23(11): 9-19.

[14]SAGOO M K, GNUDI L. Diabetic nephropathy: is there a role for oxidative stress[J]. Free Radical Biology Medicine, 2018, 116:50-63.

[15]RABILLOUD T, CHEVALLET M, LUCHE S, et al. Oxidative stress response: a proteomic view[J]. Expert Review of Proteomics, 2005, 2(6): 8-14.

[16]RABILLOUD T, CHEVALLET M, LUCHE S, et al. Oxidative stress response: a proteomic view[J]. Expert Review of Proteomics, 2008, 2(6): 949-956.

[17]FORBES J M, COUGHLAN M T, Cooper M E. Oxidative stress as a major culprit in kidney disease in diabetes[J]. Diabetes, 2008,57(6): 1446-1454.

[18]KANWAR Y S, SUN L, XIE P, et al. A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy[J]. Annual Review of Pathology, 2011, 6(1): 395-423.

[19]中華醫(yī)學會糖尿病學分會. 中國2型糖尿病防治指南(2013年版)[J]. 中國醫(yī)學前沿雜志: 電子版, 2015, (3): 26-89.

[20]SHIBU M A, RAVICHANDRAN M, SHANMUGAVADIVU M,et al. Pharmacological benefits of neferine - a comprehensive review[J]. Life Sci, 2018, 199: 60-70.

[21] GUAN G, HAN H, YANG Y, et al. Neferine prevented hyperglycemia-induced endothelial cell apoptosis through suppressing ROS/Akt/NF-κB signal[J]. Endocrine, 2014, 47(3):764-771.

[22]查錫良, 藥立波. 生物化學與分子生物學[M]. 第8版. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2013: 246-249.

[23]KIM J, LIM J, KANG B Y, et al. Capillarisin augments antioxidative and anti-inflammatory responses by activating Nrf2/HO-1 signaling[J]. Neurochemistry International, 2017, 105: 11-20.

[24]ABRAHAM N G, CAO J, SACERDOTI D, et al. Heme oxygenase: the key to renal function regulation[J]. American Journal of Physiology Renal Physiology, 2009, 297(5): 1137-1152.

[25]DA S J, ZAND B A, YANG L M, et al. Heme oxygenase isoformspecific expression and distribution in the rat kidney[J]. Kidney International, 2001, 59(4): 1448-1457.

[26]MAAMOUN H, ZACHARIAH M, MCVEY J H, et al. Heme oxygenase (HO)-1 induction prevents endoplasmic reticulum stress-mediated endothelial cell death and impaired angiogenic capacity[J]. Biochemical Pharmacology, 2017, 127(Suppl 4): 46-59.

[27]ZHANG C, LI C, CHEN S, et al. Berberine protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity in PC12 cells and zebrafish through hormetic mechanisms involving PI3K/AKT/Bcl-2 and Nrf2/HO-1 pathways[J]. Redox Biology, 2017, 11(C):1-11.

[28]LI W, ZHI W, LIU F, et al. Atractylenolide I restores HO-1 expression and inhibits Ox-LDL-induced VSMCs proliferation,migration and inf l ammatory responses in vitro[J]. Experimental Cell Research, 2017, 353(1): 26-34.