Hedgehog通路對(duì)肺腺癌增殖、凋亡及間隙連接蛋白Cx32和Cx43表達(dá)的影響

(1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院腫瘤血液科，吉林 長(zhǎng)春 130033； 2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院發(fā)育行為兒科)

肺癌是我國(guó)發(fā)病率及死亡率居于第1位的惡性腫瘤，其中腺癌是最常見(jiàn)的病理類型[1]。雖然表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑、免疫治療等的應(yīng)用，明顯提高了肺腺癌病人的生存期，但其發(fā)生轉(zhuǎn)移仍極為常見(jiàn)[2]。所以，研究肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于研發(fā)新型藥物至關(guān)重要。Hedgehog通路激活是腫瘤干細(xì)胞的重要特征，與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究Hedgehog阻斷劑環(huán)巴胺對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的體外生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，以及對(duì)細(xì)胞凋亡與間隙連接蛋白32(Cx32)、Cx43胞膜表達(dá)的影響，初步探索Hedgehog通路在肺腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫(kù)。MEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，環(huán)巴胺購(gòu)買自美國(guó)Biomol公司，胰蛋白酶、MTS以及DMSO購(gòu)買自美國(guó)Sigma公司，Anne-xiV-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自凱基公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記CX43及Cx32單克隆抗體購(gòu)自上海信然公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將A549細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素MEM培養(yǎng)基于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%后，用含EDTA胰酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，接種于96孔板中，每孔加100 μL細(xì)胞懸液(約5×103個(gè)細(xì)胞)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2條件下培養(yǎng)。24 h后棄各孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入含不同濃度環(huán)巴胺培養(yǎng)基，濃度為0(陰性對(duì)照)、10、20、30和40 μmol/L。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入5 g/L的MTS溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，小心吸棄各孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液，加入0.5 g/L DMSO，每孔100 μL，在水平搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞DMSO組(空白對(duì)照組)。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度(A)值，取平行對(duì)照孔均值。將吸光度值代入公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，比較不同濃度及時(shí)間細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值)×100%。

1.4 AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率

取環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞48 h的半數(shù)的致死量40 μmol/L為作用濃度，Annexin V-FITC、PI雙標(biāo)記染色，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞作用48 h的凋亡效應(yīng)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)環(huán)巴胺對(duì)A549胞膜Cx32及Cx43表達(dá)的影響

細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，以2 g/L胰酶消化至單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞后，按每孔2 mL(約5×105個(gè)細(xì)胞)將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后棄去原培養(yǎng)基，加入含不同濃度環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，濃度分別為0(陰性對(duì)照組)、40 μmol/L，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。藥物處理48 h后，刮除細(xì)胞并收集；以0.1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次(1 000 r/min離心10 min)；分別加入100 μL 1∶100 FITC-Cx32(或Cx43)稀釋液；4 ℃、避光孵育1 h后加入0.1 mol/L PBS 300 μL，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞膜Cx32及Cx43的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

與陰性對(duì)照組比較，當(dāng)環(huán)巴胺濃度達(dá)10 μmol/L或以上時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制。處理組A549細(xì)胞經(jīng)10、20、30和40 μmol/L環(huán)巴胺作用24 h后，生長(zhǎng)的抑制率分別為10.23%±1.25%、18.31%±2.11%、25.18%±2.92%、39.75%±4.24%；于48 h后分別為20.12%±2.45%、28.60%±2.61%、36.25%±3.16%、50.04%±4.89%；72 h后分別為32.51%±3.83%、45.34%±3.60%、65.76%±4.31%、74.52%±5.52%(P<0.05)。環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用隨濃度增加而增大，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表明環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用具有濃度、時(shí)間依賴性(圖1)。

圖110、20、30和40μmol/L環(huán)巴胺作用24、48和72h對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

2.2 環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞凋亡作用

經(jīng)40 μmol/L環(huán)巴胺作用于A549細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率為16.25%±1.52%，明顯高于陰性對(duì)照組的10.23%±0.99%(P<0.05)。見(jiàn)圖2。表明環(huán)巴胺抑制細(xì)胞生長(zhǎng)可能是通過(guò)促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡所致。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞膜Cx32及Cx43表達(dá)的影響

環(huán)巴胺可增加A549細(xì)胞Cx32及Cx43的胞膜表達(dá)。以40 μmol/L環(huán)巴胺作用A549細(xì)胞48 h后，胞膜Cx32陽(yáng)性表達(dá)率(69.65%±3.56%)明顯高于陰性對(duì)照組(41.58%±2.61%)(P<0.05)；胞膜Cx43陽(yáng)性表達(dá)率(22.12%±1.69%)明顯高于陰性對(duì)照組(9.96%±1.48%)(P<0.05)。

3 討 論

Hedgehog通路是胚胎發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，并在脊椎動(dòng)物中高度保守[4]。該通路在無(wú)配體時(shí)，跨膜信號(hào)受體Ptch抑制SMO的活性，導(dǎo)致磷酸化的GLI的蛋白酶體降解，無(wú)法發(fā)揮相應(yīng)作用；但存在Hh配體時(shí)，其通過(guò)結(jié)合Ptch受體，促使GLI從SMO復(fù)合體釋放并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，激活Hedgehog通路下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

圖2 40 μmol/L環(huán)巴胺對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

近期研究表明，Hedgehog通路與肺腺癌密切相關(guān)。Hedgehog過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[4-5]。Hedgehog通路激活亦與肺腺癌常規(guī)治療藥物如順鉑[6-7]以及EGFR抑制劑[6，8]等耐藥有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，siRNA阻斷Hedgehog通路可逆轉(zhuǎn)肺腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，并使肺腺癌再次對(duì)順鉑及厄洛替尼敏感[6]；SMO抑制劑SANT-1亦可以提高肺腺癌對(duì)EGFR抑制劑的敏感性[9]。而且，Hedgehog通路是肺腺癌的一項(xiàng)獨(dú)立不良預(yù)后因素，肺腺癌腫瘤組織Shh及GLI免疫組化陽(yáng)性提示總生存時(shí)間縮短[10]。本研究以環(huán)巴胺阻斷肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，發(fā)現(xiàn)環(huán)巴胺可抑制A549細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，證實(shí)Hedgehog通路可影響A549細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。Cx是細(xì)胞縫隙連接的基本組成單位，Cx可通過(guò)縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊，維持組織中細(xì)胞群的代謝和生長(zhǎng)的均衡性以及協(xié)調(diào)性。而腫瘤組織中Cx胞膜表達(dá)往往減少，影響腫瘤的生物學(xué)行為。多項(xiàng)研究證實(shí)，Cx與肺腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Cx43在Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化差的非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)減低[11-12]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cx43可抑制肺癌的增殖及轉(zhuǎn)移[12]，并可通過(guò)防止EMT，逆轉(zhuǎn)A549細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性[13]。Cx43表達(dá)水平與肺腺癌OS及PFS有關(guān)，Cx43低表達(dá)者的OS及PFS均劣于高表達(dá)者。

以往研究證實(shí)，Cx與Hedgehog通路之間存在關(guān)聯(lián)，二者在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有協(xié)同作用。為進(jìn)一步探索Hedgehog通路在肺腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了阻斷前后A549細(xì)胞胞膜Cx32、Cx43的變化。研究結(jié)果顯示，阻斷Hedgehog通路可增加Cx43及Cx32胞膜表達(dá)，表明Hedgehog通路可抑制肺腺癌細(xì)胞Cx43及Cx32的胞膜表達(dá)，減弱細(xì)胞間的制約作用。Hedgehog過(guò)表達(dá)促進(jìn)肺腺癌轉(zhuǎn)移可能與此有關(guān)。

綜上所述，Hedgehog通路可能參與抑制肺腺癌細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)Cx43及Cx32的胞膜表達(dá)。

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