鈣結合蛋白S100A1對卵巢癌細胞A2780增殖和遷移的影響

(青島大學附屬醫院婦產科，山東 青島 266003)

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在女性生殖系統惡性腫瘤中發病率居第三位，但死亡率位居第一。卵巢癌發病隱匿，早期不易發現，就診時卵巢癌患者中大多數都處于病變晚期，即使積極治療預后仍然不良。因此，深入探索卵巢癌發生發展的分子機制對于卵巢癌的診斷和治療有著重要的意義。S100家族是EF-手型鈣結合蛋白家族中最大的亞家族，與多種腫瘤的發生發展、侵襲和轉移有關。S100A1作為其中一員，在多種腫瘤中異常表達，但是在卵巢癌中的作用機制仍然不清。因此，本課題以卵巢癌細胞A2780作為研究對象，探討S100A1對卵巢癌細胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

293T細胞和卵巢癌細胞A2780獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，由婦產科實驗室惠存；針對S100A1的shRNA為課題組前期構建；質粒PLP1、PLP2和VSVG由中國醫學科學院腫瘤醫院劉芝華教授惠贈；RPMI 1640培養基以及嘌呤霉素(美國GIBCO公司)；胎牛血清以及轉染試劑Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(美國ABI公司)；實時定量PCR試劑盒(日本Takara公司)；Western blot試劑(美國Pierce公司)；β-Actin抗體和二抗IgG(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)；Transwell小室購買自美國Costar Cambridge公司；單克隆鼠抗S100A1抗體購買自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞培養

將293T細胞及卵巢癌細胞A2780置于含體積分數0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基中進行培養，培養基置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中，每1～2天換液一次，對數生長周期傳代，細胞貼壁生長，待細胞覆蓋培養基底壁85%的表面時收集細胞，用于后續實驗。

1.3 細胞轉染及分組

本研究將空質粒pLVX-IRES-Neo以及帶有S100A1反向序列目的基因的質粒pLVX-IRES-Neo-shS100A1分別與質粒PLP1、PLP2以及VSVG共同轉染293T細胞，實驗轉染過程嚴格地按照Lipofectamine 2000說明書進行。收集病毒上清液，將重組慢病毒感染卵巢癌細胞A2780用嘌呤霉素篩選細胞2周以獲得穩定表達的細胞株，分別獲得對照組細胞株(對照組)和實驗組細胞株(實驗組)。靶向S100A1的shRNA的序列為:5′-GATCCGTGGACTTCCAGGAGTATGTGCTTCCTGTC-AGACACATACTCCTGGAAGTCCACTTTTTG-3′。

1.4 實時定量PCR檢測S100A1 mRNA水平

提取實驗組以及對照組的A2780細胞的總RNA，后采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。將SYBR Green染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、dNTP 1 μL、Taq聚合酶2 μL、待測cDNA 5 μL、ddH2O 30 μL配置成總體積50 μL的實時定量PCR反應體系。PCR的反應條件為：95 ℃預變性2 min；然后93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共進行40個循環；最后以72 ℃延伸7 min。引物序列如下：S100A1-F：5′-CCGCTCGAGAGCAGCCACATTTGCAACCT-3′；S100A1-R:5′-CGCGGAT-CCGCTGGTGAGAGA-3′；β-action-F:5′-GGCGG-CACCACCATGTACCCT-3′；β-action-R:5′-AGG-GGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.5 蛋白質印跡法檢測S100A1蛋白質表達水平

將實驗組及對照組的A2780細胞裂解后提取總蛋白，用質量分數為0.10的SDS-PAGE分離后轉至聚偏二氟乙烯膜上，用含體積分數0.05的胎牛血清封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，在4 ℃下孵育過夜，洗膜，加入1∶5 000稀釋的二抗，在室溫下反應1 h，洗膜。β-action以相同方法進行實驗并作為內參照。采用增強型化學發光檢測系統檢測S100A1蛋白質表達水平。

1.6 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力

將實驗組及對照組A2780細胞以3×107個/L接種于96孔板中，每組設5孔平行對照。分別培養24、48、72 h后向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，室溫下繼續培養細胞1 h，用分光光度法測定波長450 nm處各孔的吸光度(A)值，實驗重復3次，取均值。

1.7 Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力

將實驗組及對照組的A2780細胞用0.25 g/L的胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，將1.5×104個細胞接種于含無血培養基200 mL的Transwell小室中，此為上室，下室加入含體積分數0.10胎牛血清的培養基500 mL，培養24 h后用濕棉簽擦去微孔膜上層未穿透小室的細胞，風干后用含質量分數0.20的甲醇固定，用含質量分數0.03的結晶紫染色，在顯微鏡下計數隨機選取的5個視野中的穿膜細胞數，實驗重復3次，取均值。

1.8 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力

將實驗組及對照組的A2780細胞接種于6孔板中培養過夜，至細胞融合至單層狀態時，用相同寬度的無菌吸頭做“+”字劃痕，用PBS反復沖洗孔板去除細胞碎片，更換含體積分數0.10的胎牛血清培養基，立即記錄劃痕寬度并拍照，室溫下繼續培養細胞，48 h后在相同的位置記錄劃痕寬度并拍照對比劃痕愈合情況。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 穩定表達敲降S100A1的A2780細胞株的構建與鑒定

實時定量PCR檢測結果顯示，對照組與實驗組的S100A1 mRNA表達水平分別為1.000±0.001、0.654±0.007，與對照組相比較，實驗組A2780細胞中S100A1 mRNA的水平顯著下降(t=83.898，P<0.05)。蛋白質印跡法檢測結果顯示，實驗組A2780細胞中S100A1蛋白質表達水平較對照組下降。見圖1。結果顯示，成功建立了敲降S100A1的A2780細胞株，可用于后續研究。

圖1 兩組A2780細胞中S100A1 mRNA蛋白表達水平比較

2.2 敲降S100A1對A2780細胞增殖能力的影響

CCK-8實驗檢測結果顯示，與對照組相比，實驗組A2780細胞在第48、72小時的細胞增殖能力明顯下降,差異具有顯著意義(t=4.975、7.393，P<0.05)。見表1。

2.3 敲降S100A1對A2780細胞遷移能力的影響

Transwell小室實驗結果顯示，對照組以及實驗組的穿膜細胞數分別為274.750±21.093、185.750±39.373，實驗組A2780細胞的穿膜細胞數顯著小于對照組(t=3.985，P<0.05)。劃痕愈合實驗檢測結果提示，敲降S100A1的A2780細胞在48 h后的劃痕愈合能力較對照組減弱。見圖2。

表1 各組細胞增殖能力的變化

①、③為對照組，②、④為實驗組，HE染色，100倍。

3 討 論

卵巢癌是全球女性癌癥的相關死亡的第5大原因[1]，每年預計有22 000多新發病例，5年生存率低于30%[2]。缺乏早期診斷是卵巢癌病人預后不良的主要原因。關于卵巢癌的發病原理及分子機制目前仍不明確。

S100A1是S100蛋白家族中的一員，定位于人染色體1q21，作為多功能信號因子參與不同細胞生物過程的調控[3]。與大多數的S100家族成員一樣，S100A1通過與鈣離子結合而發生自身構象改變，從而結合相應靶蛋白發揮相應生物學效應[4]。目前已知S100A1的靶蛋白有：Ca2+信號轉導蛋白，細胞骨架和絲連蛋白(如微管蛋白、F-肌動蛋白、中間絲)，神經遞質釋放相關蛋白(如突觸蛋白Ⅰ、Ⅱ)，轉錄因子(如p53)，酶以及其他的Ca2+激活蛋白(如S100B、S100A4、S1001P)等[5-7]。S100A1與不同靶蛋白結合后可參與肌肉收縮、細胞代謝以及腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲以及遷移等多種生物過程[8-9]。S100A1與人體多種疾病有關，如神經系統疾病、代謝綜合征、心力衰竭衰等[10-12]。WRIGHT等[13]研究顯示，S100A1過表達可促進神經系統疾病如阿茲海默癥的病理進展；EBRAHIMI等[14]研究顯示，S100A1與脂肪的生成以及肥胖的發展等有關；DU等[15]的研究顯示，S100A1可調控心肌細胞內Ca2+轉運，心力衰竭時S100A1表達減少，并通過實驗證明敲降S100A1的心肌細胞凋亡增加、心力衰竭進程加快、心肌梗死后心力衰竭的發生率升高。ERYILMAZ等[16]研究顯示，S100A1可作為評估某些癌癥化療心臟毒性的潛在標志物。

S100A1與多種腫瘤的發生發展有關[17]。據報道，S100A1在多種腫瘤中表達上調，如腎癌、乳腺癌、黑色素瘤等[3]。但也有研究顯示，S100A1在某些腫瘤如口腔癌、膀胱癌中表達下降[18-20]。研究顯示，S100A1在不同亞型的腎臟腫瘤中表達不一，可用于鑒別腎嫌色細胞癌、腎嗜酸細胞乳頭狀癌與腎嗜酸細胞腺瘤[21-22]。目前關于S100A1與卵巢癌的研究較少。DERYCKE等[23]研究結果顯示，在卵巢漿液性囊腺癌中S100A1的陽性率及表達程度高于其他病理類型，且S100A1的表達程度隨著卵巢癌Silverberg分級的增加而增加，該研究還發現在子宮內膜癌及宮內膜樣卵巢癌中S100A1陽性病人的無復發生存率下降，說明S100A1可能與卵巢癌的病理類型、腫瘤分級及預后有關。此外，雖然S100A1在不同卵巢癌亞型中表達不一，但目前在臨床實踐中仍難以通過S100A1免疫組化標記來區分卵巢癌的不同亞型[24-25]。本課題組在前期研究中證實，與正常卵巢組織相比，S100A1在卵巢癌組織中的表達明顯上調，可能在卵巢癌的發生發展中發揮重要的作用。因此，本研究通過分子功能學實驗進一步對S100A1在卵巢癌發生發展中的功能角色進行驗證。同時本研究成功建立了敲降S100A1的卵巢癌A2780細胞株，通過細胞增殖實驗及遷移實驗證實了敲降S100A1后的卵巢癌A2780細胞增殖及遷移能力明顯減弱，證明了S100A1在調控卵巢癌細胞的增殖和遷移中起重要作用，與卵巢癌的發生發展密切相關。S100A1在卵巢癌中的作用機制仍不清楚，S100A1過表達促進卵巢癌的侵襲和轉移可能與NF-κB信號傳導途徑的激活有關[20]，但具體分子機制有待進一步研究。

綜上所述，鈣結合蛋白S100A1可能通過促進卵巢癌細胞的增殖能力及遷移運動能力，進而促進卵巢癌的發展與轉移。S100A1有望成為監測卵巢癌的有力標志物以及可能的治療靶點，值得進一步研究。

[參考文獻]

[1] SIEGEL R L, MILLER K D, JEMAL A, et al. Cancer statistics, 2017[J]. CA Cancer J Clin, 2017,67(1):7-30.

[2] MILLER K D, SIEGEL R L, LIN C C, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(4):271-289.

[3] BRESNICK A R, WEBER D J, ZIMMER D B, et al. S100 proteins in cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2015,15(2):96-109.

[4] GRYCOVA L, HOLENDOVA B, LANSKY Z, et al. Ca2+binding protein S100A1 competes with calmodulin and PIP2 for binding site on the C-terminus of the TPRV1 receptor[J]. ACS Chem Neurosci, 2015,6(3):386-392.

[5] WRIGHT N T, CANNON B R, ZIMMER D B. S100A1: structure, function, and therapeutic potential[J]. Curr Opin Chem Biol, 2009,3(2):138-145.

[6] BENNETT M K, SWEET W E, BAICKER-MCKEE S, et al. S100A1 in human heart failure: lack of recovery following left ventricular assist device support[J]. Circ Heart Fail, 2014,7(4):612-618.

[7] MELVILLE Z, ALIGHOLIZADEH E, MCKNIGHT L E, et al. X-ray crystal structure of human calcium-bound S100A1[J]. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun, 2017,73(Pt 4):215-221.

[8] MELVILLE Z, HERNANDEZ-OCHOA E O, PRATT S J P, et al. The activation of protein kinase a by the calcium-binding protein S100A1 is independent of cyclic AMP[J]. Biochemistry, 2017,56(17):2328-2337.

[9] MACIEJEWSKI A, PRADO V F, PRADO M A M. Molecular basis for the interaction between stress-inducible phosphoprotein 1 (STIP1) and S100A1[J]. Biochem J, 2017,474(11):1853-1866.

[10] AFANADOR L, ROLTSCH E A, HOLCOMB L, et al. The Ca2+sensor S100A1 modulates neuroinflammation, histopathology and Akt activity in the PSAPP Alzheimer's disease mouse model[J]. Cell Calcium, 2014,56(2):68-80.

[11] DUARTE-COSTA S, CASTRO-FERREIRA R, NEVES J S. S100A1: a major player in cardiovascular performance[J]. Physiol Res, 2014,63(6):669-681.

[12] DIAZ-ROMERO J, NESIC D. S100A1 and S100B: Calcium sensors at the cross-roads of multiple chondrogenic pathways[J]. J Cell Physiol, 2017,232(8):1979-1987.

[13] WRIGHT N T, CANNON B R, ZIMMER D B. S100A1: structure, function, and therapeutic potential[J]. Curr Chem Biol, 2009,3(2):138-145.

[14] EBRAHIMI E, KHEIROURI S, ALIZADEH M. Down-regulation of S100A1 protein in patients with metabolic syndrome and its association with zinc-α2-glycoprotein [J]. Scott Med J, 2017,62(3):88-95.

[15] DU X J, COLE T J, TENIS N, et al. Impaired cardiac contractility response to hemodynamic stress in S100A1-deficient mice[J]. Mol Cell Biol, 2002,22(8):2821-2829.

[16] ERYILMAZ U, DEMIRCI B, AKSUN S, et al. S100A1 as a potential diagnostic biomarker for assessing cardiotoxicity and implications for the chemotherapy of certain cancers[J]. PLoS One, 2015,10(12):e0145418.

[17] SALAMA I, MALONE P S, MIHAIMEED F. A review of the S100 proteins in cancer[J]. Eur J Surg Oncol, 2008, 34(4):357-364.

[18] TYSZKIEWICZ T, JARZAB M, SZYMCZYK C, et al. Epidermal differentiation complex (locus 1q21) gene expression in head and neck cancer and normal mucosa[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2014,52(2):79-89.

[19] YAO R, LOPEZ-BELTRAN A, MACLENNAN G T, et al. Expression of S100 protein family members in the pathogenesis of bladder tumors[J]. Anticancer Res, 2007,27(5A):3051-3058.

[20] RAFFAT M A, HADI N I, HOSEIN M, et al. S100 proteins in oral squamous cell carcinoma[J]. Clin Chim Acta, 2018,480:143-149.

[21] CONNER J R, HIRSCH M S, JO V Y. HNF1β and S100A1 are useful biomarkers for distinguishing renal oncocytoma and chromophobe renal cell carcinoma in FNA and core needle biopsies[J]. Cancer Cytopathol, 2015,123(5):298-305.

[22] NG K L, MORAIS C, BERNARD A, et al. A systematic review and meta-analysis of immunohistochemical biomarkers that differentiate chromophobe renal cell carcinoma from renal oncocytoma[J]. J Clin Pathol, 2016,69(8):661-671.

[23] DERYCKE M S, ANDERSEN J D, HARRINGTON K M, et al. S100A1 expression in ovarian and endometrial endometrioid carcinomas is a prognostic indicator of relapse-free survival[J]. Am J Clin Pathol, 2009,132(6):846-856.

[24] YORDANOV A, IVANOV I, POPOVSKA S, et al. Evaluation of the expression of S100A1 protein in serous, mucinous and endometroid ovarian carcinoma[J]. Akush Ginekol (So-fiia), 2013,52(5):22-26.

[25] HIBBS K, SKUBITZ K M, PAMBUCCIAN S E, et al. Diffe-rential gene expression in ovarian carcinoma: identification of potential biomarkers[J]. Am J Pathol, 2004:165(2):397-414.