ChRM3對膽管癌神經浸潤的影響

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266003 1 肝膽外科; 2 嶗山院區業務部)

膽管癌是一種惡性程度極高，具有高度侵襲性的腫瘤，起病隱匿，早期即可發生周圍浸潤及遠處轉移，具有診斷率低，病死率高的特點[1]。手術切除是唯一有效的治療方法，但是手術切除率低，術后復發率高，對放、化療不敏感，導致其預后較差[2]。近年來研究顯示，膽管癌術后易復發及預后差與其具有的一種生物學特性—神經浸潤密切相關。研究表明膽管系統具有十分豐富的自主神經，膽管惡性腫瘤距腹腔神經叢的距離較近，腫瘤易侵犯周圍的神經叢，發生神經浸潤[3]。許多學者認為，膽管癌周圍神經遞質的分泌對膽管癌的神經浸潤具有積極影響。我們推測周圍神經遞質可能是通過激活毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3(ChRM3)來發揮作用，ChRM3在膽管癌神經浸潤過程中起到重要作用，本實驗目的是通過建立體外神經浸潤模型，觀察ChRM3在激動劑匹羅卡品及其拮抗劑阿托品作用下對膽管癌神經浸潤能力的影響。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2010年1月—2013年12月，我院肝膽外科手術切除后經石蠟包埋的膽管病理組織標本90例，其中60例為腺癌組織標本，30例為正常膽管組織標本。

1.2 細胞系和主要試劑

膽管癌RBE細胞系購自中國科學院上海細胞庫，RPIM1640培養基以及胎牛血清(FBS)由美國Hyclone公司提供，匹羅卡品購自美國Sigma公司，硫酸阿托品由武漢昌恒生物醫藥制品研究所提供，昆明種純系胚胎小鼠由青島市藥檢所動物實驗中心提供。

1.3 細胞培養

RBE膽管癌細胞系，用含體積分數0.10胎牛血清的RPMI 1640培養液，于37 ℃、含體積分數0.05的CO2的恒溫培養箱內進行培養，定期換液，待細胞80%～90%融合后用含有2.5 g/L EDTA的胰酶消化，配成細胞懸液，接種于培養瓶，取對數生長期的細胞用含2.5 g/L EDTA的胰酶消化備用，每天用倒置顯微觀察細胞生長情況，定期拍照記錄。

1.4 免疫組化法檢測ChRM3的表達情況

標本均采用40 g/L中性甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，采用免疫組化PV-6000二步法對切片進行免疫組化染色。每批實驗均設陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。免疫組化陽性判斷標準為細胞膜及細胞質出現棕褐色顆粒，分級如下：隨機選擇8～10個視野(100倍)的陽性細胞核的數目來進行半定量評估，分為4級：陰性(-)，陽性細胞數<5%；弱陽性(+)，陽性細胞數占5%～25%；陽性()，陽性細胞數占26%～50%；強陽性()，陽性細胞數>50%；所有標本均經2名病理科高年資主治醫師審核證實。

1.5 體外膽管癌神經浸潤模型的建立

本實驗小鼠DRG-RBE細胞共培養模型培養液分共為4組，分別為mock組(單獨加含血清RPMI 1640培養基)、PILO組(含有血清RPMI 1640培養基+匹羅卡品1 mmol/L)、PILO+ATR組(含血清RPMI 1640培養基+匹羅卡品1 mmol/L+阿托品0.1 mmol/L)、ART組(含有血清RPMI 1640培養基+阿托品0.1 mmol/L)。取對數期生長的RBE膽管癌細胞用2.5 g/L胰酶消化，離心并重懸于含胎牛血清RPMI 1640培養液中，細胞計數板計數，調整細胞密度至1.0×108個/L備用。整個操作在超凈工作臺上進行，將小鼠脫頸處死，在顯微鏡下切取并修剪背根神經節(DRG)后置于生理鹽水中清洗備用。6孔板各孔均放入0 ℃預冷的1 cm×1 cm大小的消毒蓋玻片，將備用的DRG置于蓋玻片中央，從冰浴中取50 μL Matrigel覆于DRG上，然后將6孔板置于37 ℃培養箱中，固化30 min后分別加入預先制備好的細胞懸液2 mL，將Matrigel和DRG完全覆蓋，操作完后將6孔板置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中培養，每隔4 h倒置顯微鏡下觀察RBE細胞與神經纖維的黏附狀況，并照相記錄。36 h后經40 g/L中性甲醛溶液固定，通過Nissl染色、Gomori染色和神經絲蛋白免疫組化染色(NF IHC)后，置于倒置顯微鏡下觀察，在高倍鏡下計數，分別取5個高倍鏡視野下細胞計數，并取平均值。

2 結 果

2.1 ChRM3在兩種組織中的表達

ChRM3在膽管癌組織和正常膽管組織中的陽性表達率分別為90.00%(54/60)、3.33%(1/30)，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1a、b。并且神經浸潤在膽管癌組織中發生率為91.7%(55/60)。見圖1c、d。

2.2 各組RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維的比較

通過Nissl染色發現，體外培養的DRG存活良好，其尼氏體呈顆粒狀，核周尼氏體顆粒明顯，核邊緣處較小，而且活力旺盛(圖2a)。Gomori染色以及NF IHC染色見有神經突起自DRG周緣長出，多數突起結構有分支，大體呈放射狀排列(圖2b、c、d)。在DRG-RBE細胞共培養模型培養36 h后，可見RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維(圖3a)，浸潤細胞數目為18.00±0.71，在DRG-RBE細胞共培養模型中加入匹羅卡品后，RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維的數量明顯增加(圖3b)，浸潤細胞數目為31.60±0.93，差異具有統計學意義(t=11.66,P<0.05)。在加入匹羅卡品拮抗劑阿托品后明顯減弱，表現為浸潤DRG的RBE 細胞的數量減少(圖3c)，浸潤細胞數目為20.00±0.71，差異具有統計學意義(t=9.95,P<0.05)。而在DRG-RBE細胞共培養模型中單獨加入阿托品以后，RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維的數量無明顯的變化(圖3d)，浸潤細胞數目為20.20±0.86，與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

肝膽系惡性腫瘤中，膽管癌是除肝癌之外發病率最高的惡性腫瘤，約占10%～15%。手術根治性切除是膽管癌唯一有效的治療方法，但由于膽管癌早期不易被發現，且易發生周圍浸潤，導致大部分病人診斷時已處于中晚期，R0切除率降低且術后復發率升高。

a：ChRM3在正常膽管組織中的表達，200倍；b：ChRM3在膽管癌組織中的表達，200倍；c、d：膽管癌浸潤神經纖維(箭頭所指)，PV-6000染色，分別為200、400倍。

圖1ChRM3在兩種組織中的表達情況

a:Nissl著色后的DRG(箭頭所指),400倍；b、c:Gomori著色后的DRG(箭頭所指)，分別為200、400倍；d:NF IHC著色后的DRG(箭頭所指)，400倍。

圖2DRG體外培養36h后的生長狀態、胞體大小及軸突生長狀況

a：RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維情況；b：加入匹羅卡品后RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維情況；c：同時加入匹羅卡品和阿托品后RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維情況；d：單獨加入阿托品后RBE細胞浸潤DRG及其周圍神經纖維情況。

圖3不同因素影響下RBE細胞對DRG的浸潤情況

神經浸潤是膽管癌一種獨立的轉移方式，與淋巴轉移無關[4]。BHUIYA等[5]的研究顯示， 70例膽管癌標本中81.4%出現了神經浸潤，且R0術后5年存活率僅為32%，而無神經浸潤病人為67%。以上研究顯示，神經浸潤在膽管癌中普遍發生且與術后復發相關。膽管系統是一個由多種神經支配的自主神經器官。許多學者認為腫瘤的神經浸潤可能與神經遞質有關，尤其是膽管癌這種具有嗜神經浸潤性的腫瘤[6]。研究顯示膽管癌周圍的交感神經遞質及其受體在調節膽管癌的生長及轉移中的重要作用已經被證實[7-8]，但是副交感神經在膽管癌中作用的研究尚少。SHAH等[9]以及SAID等[10]研究表明，副交感神經也與腫瘤的發生發展關系密切。mAChRs是副交感神經分泌的主要遞質乙酰膽堿(ACh)受體的一種，包括M1～M5 5種受體，其中，ChRM3分布于消化道腺體和血管平滑肌，控制腺體分泌和平滑肌松弛。實驗證明，ACh在多種腫瘤中高表達，包括常見的肺癌及其他惡性腫瘤[11-12]。研究顯示ChRM3在消化道腫瘤中廣泛表達，在腫瘤的增殖、分化、侵襲和轉移中起重要作用[13-14]。張亮等[15]研究顯示，ChRM3活化能夠通過PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞的侵襲和轉移。據報道，膽管癌細胞系MZ-Cha-1有ChRM3的表達，而在mAChRs激動劑作用下，IP3信號被激活，細胞內Ca2+水平升高，膽管癌細胞的數量增加[16]。FENG等[17]研究顯示，ChRM3的表達在膽管癌細胞增殖和轉移中起關鍵作用，并受腫瘤分化程度、遠處轉移的影響。以上研究證明，ChRM3廣泛參與了腫瘤細胞，包括膽管癌細胞的增殖、分化、侵襲和轉移，但是與神經浸潤有關的報道很少。本課題組之前的研究已經證實了膽管癌細胞可能存在ChRM3，并受副交感神經分泌的神經遞質的調節，在膽管癌的侵襲和轉移中發揮積極作用[18]。對本院90例標本進行免疫組織化學染色顯示，ChRM3主要在膽管癌細胞膜和細胞質中表達，膽管癌組織中神經浸潤的發生率約為91.7%，并且在膽管癌組織中ChRM3的陽性表達率明顯高于正常膽管組織。據此推測，ChRM3可能與膽管癌神經浸潤具有相關性。研究顯示，腫瘤組織中存在多種神經遞質的異常表達，神經遞質和受體激動劑可影響腫瘤的增殖、分化和轉移，受體拮抗劑可阻斷這些作用[19]。而本研究結果顯示，加入匹羅卡品或阿托品后，ChRM3激動劑匹羅卡品可明顯增強RBE細胞對DRG及周圍神經纖維的浸潤能力；而阿托品可明顯抵消匹羅卡品所產生的促浸潤作用；阿托品能夠與匹羅卡品競爭與ChRM3結合，對匹羅卡品的作用產生競爭性抑制，而阿托品本身與ChRM3結合不發揮作用，所以單獨應用阿托品對RBE細胞的神經浸潤無影響。

綜上所述，匹羅卡品可明顯增強膽管癌細胞的神經浸潤能力，阿托品可明顯抵消匹羅卡品所產生的促浸潤能力，其機制可能通過改變ChRM3的活性而發揮作用。這可能為抑制膽管癌的神經浸潤提供新的治療靶點。

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