葉酸靶向的納米金載體構建及其對HeLa細胞殺傷作用的研究

(青島大學醫學部公共衛生學院，山東 青島 266021)

惡性腫瘤傳統的三大治療方式是放療、化療、手術治療。阿霉素(DOX)是一種抗腫瘤譜廣泛的化療藥物，可以抑制DNA的合成從而達到抗腫瘤效果[1]。但是DOX具有損傷骨髓造血功能、心臟毒性大等藥物副作用[2]，如何將DOX靶向運輸到腫瘤部位并減少其在正常組織中的分布將成為研究的關鍵。隨著納米技術的發展，納米醫學受到了越來越廣泛的關注并對疾病治療提供了許多新的思路。其中，納米金由于生物相容性好、性質穩定、合成簡便、容易修飾以及無毒等優點一直是研究的熱點之一[3]，并廣泛應用于生物成像、生物傳感、載藥等領域[4-5]，所以這類金納米材料可以作為載藥平臺，結合DOX用于抗腫瘤藥物的運輸。葉酸(FA)是機體生長發育所必需的營養物質，作為一種物質合成必須的維生素，FA在增生旺盛的細胞中需求量更大[6]。FA可以通過葉酸受體(FR)進入細胞，FR在正常細胞表面低表達，而在大多數腫瘤細胞的表面過度表達，以使生長旺盛的腫瘤細胞獲得更多的FA[7]。因此，可利用FR的表達特性，將FR作為藥物靶向的重要分子，結合抗腫瘤藥物構建FA靶向的載藥平臺用于抗腫瘤研究[8]。有研究表明，人宮頸癌HeLa細胞表面FR是過量表達的[9]，而人乳腺癌MCF-7細胞表面FR是低表達的[10]。本研究以牛血清白蛋白為模板合成納米金(Au-BSA)，并以Au-BSA作為載體，結合FA提供靶向功能，結合DOX作為化療藥物，建立FA靶向的Au-BSA載體并負載阿霉素(Au-BSA-DOX-FA)，用于探討其對FR高表達的HeLa細胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源

HeLa細胞、MCF-7細胞和HSF細胞由青島大學醫學部公共衛生學院提供。

1.2 主要試劑

牛血清白蛋白(BSA)購于上海實生西巴斯科技發展有限公司；氯金酸、抗壞血酸、葉酸、順烏頭酸酐、1，4-二氧六環、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)購于國藥集團化學試劑有限公司；DOX購于美國Sigma公司。

1.3 構建Au-BSA-DOX-FA

1.3.1制備BSA修飾的Au-BSA 將10 mL質量濃度為5 g/L牛血清白蛋白溶液與1 mL濃度為10 mmol/L的氯金酸溶液混合，室溫下置于磁力攪拌器上攪拌30 min，轉速為10 00 r/min。然后加入20 mg抗壞血酸繼續攪拌2 h。溶液由最初的淺藍色首先先變為無色再變為藍紫色，說明Au-BSA已經制備完成。在透射電子顯微鏡下觀察所合成的Au-BSA，并利用紫外可見分光光度計測量其全波長吸收光譜。Au-BSA在室溫下可以穩定存在3個月以上。

1.3.2將Au-BSA與DOX和FA結合 將7 mg DOX溶解于4 mL蒸餾水中，冰水浴。將5 mg順烏頭酸酐溶解于200 μL的1，4-二氧六環中，然后緩慢加入上述DOX溶液中，并攪拌。用0.5 mol/L NaOH迅速將上述反應物的pH調至9.0，在冰水浴中反應20 min，然后用1 mol/L的HCl將pH調至7.0，攪拌30 min。隨后繼續滴加HCl直至形成較大沉淀(沉淀為順烏頭酸酐與DOX的混合物)，冰水浴15 min后，80 00 r/min離心10 min，去除上清液后，得到沉淀物。該沉淀物與7 mg EDC、3 mg NHS一起溶解于3 mL蒸餾水中，室溫黑暗中攪拌4 h，上述混合溶液與30 g/L的Au-BSA溶液2 mL混合后繼續黑暗中攪拌16 h。反應完成后，通過葡萄糖凝膠G-25分離去除多余的Au-BSA和DOX，即得到Au-BSA-DOX復合物。

將質量5 mg的FA溶解于體積1 mL DMSO中，將3 mg EDC和2 mg NHS在室溫黑暗中攪拌4 h后與上述溶液進行混合。將Au-BSA-DOX溶液(3 mL，20 g/L)加入該混合溶液，室溫黑暗中攪拌10 h，反應完成之后，通過葡萄糖凝膠G-25分離去除多余的FA，即得到Au-BSA-DOX-FA。利用紫外可見分光光度計測量其吸收光譜，從而確定該復合物是否成功合成。

1.4 Au-BSA-DOX-FA在不同pH值條件下DOX的釋放

1.4.1繪制DOX標準曲線 以2倍的濃度梯度配置不同濃度的DOX標準溶液，標準溶液濃度分別為1.875、3.75、7.5、15、30、60 mg/L。用紫外可見分光光度計在495 nm波長下測定各標準溶液的吸光度(A)值，計算回歸方程，繪制標準曲線。

1.4.2DOX的釋放 通過調節不同的pH值(pH分別為3.5、5.0、6.5、7.4、9.0)，繪制Au-BSA-DOX-FA中DOX在不同的pH值條件下的釋放曲線。將1 mL Au-BSA-DOX-FA置于透析管中，然后將透析管置于盛有10 mL氫氧化鈉和檸檬酸鈉緩沖溶液的塑料管中，塑料管中緩沖溶液的pH分別調至3.5、5.0、6.5、7.4、9.0。該測試在搖床中進行，參數設置為37 ℃，50 r/min。每隔一定時間間隔(3、6、12、24、48 h)，更換新的緩沖溶液，并用紫外可見分光光度計測定吸光度值，根據標準曲線計算緩沖溶液中DOX的含量，繪制DOX釋放曲線。

1.5 細胞毒性實驗

為了確定所合成的Au-BSA的細胞毒性，采用MTT法檢測經Au-BSA培養的HeLa細胞、MCF-7細胞和HSF細胞的活力。取對數生長期的HeLa細胞、MCF-7細胞和HSF細胞接種于96孔板，每孔加入100 μL，接種密度為1×104/孔。不同濃度的Au-BSA溶液(0、1.6、3.2、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)分別加到不同組別的孔中。置二氧化碳培養箱中培養48 h后，用pH為7.0的PBS清洗3次，向各孔中加入MTT繼續培養4 h，去除上清液后加入DMSO溶液，震蕩10 min以后采用酶標儀在570 nm波長下檢測吸光度(A)值。

1.6 對腫瘤細胞的靶向殺傷作用比較

為了確定靶向殺傷作用，用MTT實驗測定分別經Au-BSA-DOX-FA以及DOX干預的HeLa細胞、MCF-7細胞和HSF細胞活力。Au-BSA-DOX-FA干預組中，復合物中包含的DOX的濃度分別為0.045、0.09、0.185、0.375、0.75、1.5 mg/L。DOX干預組中，DOX的濃度與Au-BSA-DOX-FA干預組中包含的DOX的濃度一致。于37 ℃、含體積分數0.05二氧化碳培養箱中培養48 h后，用pH為7.0的PBS清洗3次，向各孔中加入MTT繼續培養4 h，去除上清液然后加入DMSO溶液，震蕩10 min后用酶標儀在570 nm波長下檢測吸光度(A)值。

1.7 統計學處理

數據應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，Au-BSA-DOX-FA與DOX對細胞殺傷效果比較用兩組獨立樣本比較的秩和檢驗即曼-惠特尼秩和檢驗(Mann-Whitney Test)，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 Au-BSA-DOX-FA的合成與表征

透射電子顯微鏡(TEM)鏡下，所制備的Au-BSA呈單分散的花狀結構，粒徑約50 nm(圖1)。紫外可見分光光度計測量所合成Au-BSA-DOX-FA的吸收光譜如圖2所示，FA以及DOX分別在360以及495 nm波長處有較強的吸收峰。Au-BSA在280 nm處有一個較強的吸收峰，這是牛血清白蛋白的特征峰，說明納米材料中有牛血清白蛋白的存在，Au-BSA的特征吸收峰如小圖所示，在580 nm波長處。BSA、FA以及DOX的特征吸收峰(280、360、495 nm波長處)在Au-BSA-DOX-FA的吸收曲線中均可見，說明已經成功地在Au-BSA上結合上了FA和DOX。

2.2 建立標準曲線

建立吸光度(A)值對DOX標準溶液(C)的一元線性回歸方程。495 nm波長時不同濃度DOX的吸光度(A)值隨著濃度的升高而增大，回歸方程為：A=0.044C+0.04，決定系數R2=0.999，說明在吸光度(A)值的總變異中，濃度C可以解釋吸光度(A)值變異的99.9%，即用濃度來預測吸光度的效果好，在0～60 mg/L范圍內，DOX濃度與吸光度(A)值有良好的線性關系。見圖3。

圖1 Au-BSA的TEM照片

圖2 DOX、FA、Au-BSA及Au-BSA-DOX-FA的紫外吸收光譜

圖3 DOX的標準曲線

2.3 pH敏感的藥物釋放

為達到pH敏感可控的藥物釋放效果，本研究使用順烏頭酸酐作為連接DOX與Au-BSA的藥物。DOX從Au-BSA-FA-DOX復合物上釋放的效果通過測量其在不同pH值下在緩沖溶液中的含量來反應。如圖4所示，當pH為7.4和9.0時，DOX從Au-BSA-FA-DOX復合物釋放出來的數量大約為20%。相比之下，當pH為6.5時，DOX的釋放量約為60%，釋放量是前者的3倍。當pH為3.5以及5.0時，DOX的釋放量達到了約90%，釋放量提高到4.5倍。

圖4 不同pH值情況下DOX在Au-BSA-DOX-FA中的釋放情況

2.4 Au-BSA的細胞毒性

MTT實驗測定顯示，隨著Au-BSA濃度的提高，HaLa細胞、MCF-7細胞和HSF細胞的細胞活力未受到明顯抑制(圖5a～c)，說明Au-BSA具有良好的生物相容性。

2.5 Au-BSA-DOX-FA對Hela細胞靶向殺傷作用

隨著DOX濃度的升高，HeLa和MCF-7細胞活力呈下降趨勢。從細胞活力的變化曲線可以看出，在對HeLa細胞的干預中，用Au-BSA-DOX-FA干預的HeLa細胞的活力低于DOX(t=26.0，P<0.05)；而兩者對MCF-7細胞的殺傷作用差異無顯著性(P>0.05)；采用Au-BSA-DOX-FA干預的HSF細胞活力高于DOX(t=26.5，P<0.05)。見圖6a～c。

a、b、c分別為HaLa細胞、MCF-7細胞、HSF細胞。

a、b、c分別為HaLa細胞、MCF-7細胞、HSF細胞。

3 討 論

本研究所用Au-BSA是以BSA[11]為模板，用抗壞血酸還原氯金酸得到的[12]，合成過程簡潔快速，無有毒物質產生，從而保證所合成的Au-BSA具有良好的生物相容性，MTT實驗結果也證明了這一點。有研究表明，粒徑在10～200 nm間的納米顆粒有利于在體內的長期循環和腫瘤靶向治療[13]。本研究所制備粒徑為50 nm的花狀Au-BSA，與其研究結果相符合。

人體正常組織和血液的pH值為7.4，而腫瘤組織部位的pH值比正常組織低[14]，這就為利用pH控制藥物釋放提供了條件[15]。順烏頭酸酐是一種酸性敏感鍵，在中性和堿性環境下穩定，在酸性環境下易斷裂[16-17]。有研究將DOX利用順烏頭酸酐連接到一種樹枝狀大分子上形成聚合物，這種聚合物可以在酸性條件下緩慢釋放DOX，而在中性條件下則能穩定存在[18]。緩釋藥物則能保證藥物濃度穩定在較高濃度，從而提高藥物的生物利用率。本研究中，DOX標準曲線說明，在0～60 mg/L范圍內，DOX的濃度與吸光度(A)值有良好的線性關系[19]，因此通過測定吸光度(A)來計算溶液中DOX的濃度。Au-BSA-DOX-FA在pH為3.5以及5.0時可以釋放出90%的DOX，且釋放過程在12 h內持續完成，在pH為6.5時約釋放出60%的DOX，而在中性(pH 7.4)以及堿性(pH 9.0)環境中很少釋放出DOX，總釋放量僅為DOX總量的20%左右。DOX從復合物中的快速釋放是由于順烏頭酸酐的作用，順烏頭酸酐作為DOX與Au-BSA的連接物，在pH小于6.0時極易斷裂，從而使DOX從復合物中釋放出來。有研究表明，pH敏感的DOX釋放與酸性條件下的游離羧基有關[20]。所以，pH敏感的DOX釋放效果表明，Au-BSA-FA-DOX復合物在循環系統中會穩定存在而在腫瘤部位的酸性環境中就會釋放DOX[21]。

HeLa細胞表面FR過量表達，極易與FA靶向抗腫瘤藥物結合，從而有利于藥物發揮生物學效應[22]。Au-BSA-DOX-FA與DOX對癌細胞的殺傷效果比較顯示，由于HeLa細胞表面大量FR的存在，Au-BSA-DOX-FA能夠靶向地與HeLa細胞結合并在周圍釋放結合在復合物中的DOX，而單純使用DOX干預則沒有靶向聚集功能，所以Au-BSA-DOX-FA對HeLa細胞的殺傷效果優于單純使用DOX的殺傷效果。MCF-7細胞表面FR低表達，Au-BSA-DOX-FA對其無靶向功能[23]，所以其與DOX的殺傷效果無明顯的差異。在Au-BSA-DOX-FA對MCF-7的殺傷效果中，Au-BSA-DOX-FA的效果略低于單純使用DOX的殺傷效果，可能是因為復合物中釋放的DOX的量低于直接加入DOX的量，在無靶向聚集的條件下，治療效果與DOX濃度相對應。在Au-BSA-DOX-FA對HSF的殺傷效果中，HSF細胞為正常組織細胞，表面FR低表達且周圍環境為弱堿性，Au-BSA-DOX-FA對其無靶向功能[24]，且不會因為順烏頭酸酐鍵斷裂而釋放出DOX，因此Au-BSA-DOX-FA對HSF細胞殺傷作用顯著弱于單純使用DOX的殺傷作用。

綜上所述，本研究以牛血清白蛋白為模板合成了一種生物相容性良好的Au-BSA，并將其作為FA靶向的藥物載體負載DOX組成了Au-BSA-DOX-FA，用于對FR高表達的HeLa細胞的殺傷作用研究。該復合物對表面FR過量表達的HeLa細胞有較好的殺傷作用。本研究只是進行了細胞水平的研究，該復合物在個體水平對腫瘤的治療效果如何，還需要進一步的動物實驗加以驗證。

[參考文獻]

[1] 李寧,于力方,王珊,等. 阿霉素納米粒在腫瘤治療中的應用研究[J]. 現代生物醫學進展, 2012, (30):5836-5837,5867.

[2] LIPSHULTZ S E, GRENIER M A, COLAN S D. Doxorubicin-induced cardiomyopathy[J]. N EnglJ Med. 1999,340(8):653-654.

[3] SHENG Z, HU D, ZHENG M, et al. Smart human serum albumin-indocyanine green nanoparticles generated by programmed assembly for dual-modal imaging-guided cancer sy-nergistic phototherapy[J]. ACS Nano, 2014,8(12):12310-12322.

[4] BAJAJ A, MIRANDA O R, KIM I B, et al. Detection and differentiation of normal, cancerous, and metastatic cells using nanoparticle-polymer sensor arrays[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009,106(27):10912-10916.

[5] XIAO Y, HONG H, MATSON V Z, et al. Gold nanorods conjugated with doxorubicin and cRGD for combined anticancer drug delivery and PET imaging[J]. Theranostics, 2012,2(8):757-768.

[6] 王冬,于旭紅,沙杭. 葉酸的臨床應用現狀[J]. 中國臨床藥理學雜志, 2016(19):1813-1816,1820.

[7] LU Y, LOW P S. Folate-mediated delivery of macromolecular anticancer therapeutic agents[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2012,64(5):675-693.

[8] ARONOV O, HOROWITZ A T, GABIZON A, et al. Folate-targeted PEG as a potential carrier for carboplatin analogs. Synthesis and in vitro studies[J]. Bioconjug Chem, 2003,14(3):563-574.

[9] MASTERS J R. HeLa cells 50 years on: The good, the bad and the ugly[J]. Nat Rev Cancer, 2002,2(4):315-319.

[10] CHUNG K N, SAIKAWA Y, PAIK T H, et al. Stable transfectants of human MCF-7 breast cancer cells with increased levels of the human folate receptor exhibit an increased sensitivity to antifolates[J]. J Clin Invest, 1993,91(4):1289-1294.

[11] ZHANG C, FU Y Y, ZHANG X, et al. BSA-directed synthesis of CuS nanoparticles as a biocompatible photothermal agent for tumor ablation in vivo[J]. Dalton Trans, 2015,44(29):13112-13118.

[12] GUéVEL X L, H?TZER B, JUNG G, et al. Formation of fluorescent metal (Au, Ag) nanoclusters capped in bovine se-rum albumin followed by fluorescence and spectroscopy[J]. J of Phys Chem C, 2011,115(22):10955-10963.

[13] NIIKURA K, IYO N, MATSUO Y, et al. Sub-100 nm gold nanoparticle vesicles as a drug delivery carrier enabling rapid drug release upon light irradiation[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2013,5(9):3900-3907.

[14] MANCHUN S, DASS C R, SRIAMORNSAK P. Targeted therapy for cancer using pH-responsive nanocarrier systems[J]. Life Sci, 2012,90(11-12):381-387.

[15] WEN S, LIU H, CAI H, et al. Targeted and pH-responsive delivery of doxorubicin to cancer cells using multifunctional dendrimer-modified multi-walled carbon nanotubes[J]. Adv Healthc Mater, 2013,2(9):1267-1276.

[16] XIA F, HOU W, ZHANG C, et al. pH-responsive gold nanoclusters-based nanoprobes for lung cancer targeted near-infrared fluorescence imaging and chemo-photodynamic therapy[J]. Acta Biomater, 2018,68:308-319.

[17] 魏偉,鄧吉喆,李方實,等. pH響應型mPEG-PCL嵌段共聚物膠束用作藥物運輸[J]. 精細化工, 2013,30(3):253-258,280.

[18] ZHU S J, QIAN L L, HONG M H, et al. RGD-modified PEG-PAMAM-DOX conjugate: In vitro and in vivo targeting to both tumor neovascular endothelial cells and tumor cells[J]. Adv Mater, 2011,23(12): H84-89.

[19] 陳大中,高潔,解方園,等. 共載阿霉素和依克立達的PLGA納米粒的制備及表征[J]. 藥學實踐雜志, 2017, (3):219-223,251.

[20] DU C, DENG D, SHAN L, et al. A pH-sensitive doxorubicin prodrug based on folate-conjugated BSA for tumor-targeted drug delivery[J]. Biomaterials, 2013,34(12):3087-3097.

[21] KOSHKARYEV A, SAWANT R, DESHPANDE M, et al. Immunoconjugates and long circulating systems: Origins, current state of the art and future directions[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2013,65(1):24-35.

[22] 李東紅,刁俊林,劉建倉,等. 光敏劑葉酸-卟啉對宮頸癌HeLa細胞的靶向性和光動力活性[J]. 中國激光醫學雜志, 2010, (5):273-277,336.

[23] FENG D, SONG Y, SHI W, et al. Distinguishing folate-receptor-positive cells from folate-receptor-negative cells using a fluorescence off-on nanoprobe[J]. Anal Chem, 2013,85(13):6530-6535.

[24] 胡豐,唐寧寧,劉燦,等. 以葉酸耦聯納米Fe3O4顆粒的合成和標記腫瘤實驗研究[J]. 激光生物學報, 2014, (3):211-217.