牡丹籽油乙醇輔助水酶法提取工藝優(yōu)化及品質(zhì)分析

宋媛媛楊瑞金張文斌趙 偉華 霄

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品科學與工程國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)屬芍藥科芍藥屬牡丹組，原產(chǎn)于中國西部秦嶺和大巴山一帶山區(qū)，為多年生落葉小灌木[1]。牡丹籽含油量29%～34%，含蛋白18%～22%，營養(yǎng)價值很高[2-3]。其中牡丹籽油富含不飽和脂肪酸，主要為亞麻酸和亞油酸。作為人體的必需脂肪酸，亞麻酸和亞油酸具有降低血脂、預防心腦血管疾病和動脈粥樣硬化的效用[4-6]，因此牡丹籽油作為一種富含亞麻酸的植物油，具有很高的開發(fā)價值。對牡丹籽油的毒理學研究[7]表明，牡丹籽油無急性毒性、遺傳毒性和亞急性毒性，具有很高的食用安全性。2011年3月22日，衛(wèi)生部《衛(wèi)生部關于批準元寶楓籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告》(2011年第9號)批準牡丹籽油為新資源食品。牡丹籽油正式進入了食用油的行列。

目前牡丹籽油的提取方法主要有壓榨法、溶劑浸出法、超臨界CO2萃取法以及水酶法。壓榨法提油的技術應用較早，不斷改良后，目前已經(jīng)非常成熟，但其出油率低、能耗高，餅粕殘油量高。易軍鵬等[8]比較了超聲波提取和機械壓榨法對牡丹籽油得率及其品質(zhì)的影響，結果顯示機械壓榨法牡丹籽油得率僅為18.56%，且外觀性狀和穩(wěn)定性較差。溶劑浸出法出油率高，工業(yè)應用也十分廣泛，但存在試劑殘留的安全性問題。孫明哲等[9]通過超聲波輔助石油醚浸提牡丹籽油，在優(yōu)化條件下牡丹籽油平均得率為26.76%，GC分析結果顯示牡丹籽油含有豐富的多不飽和脂肪酸。超臨界CO2萃取法雖然無毒無害無殘留，但設備昂貴，生產(chǎn)成本高，工業(yè)化應用受到極大限制。史國安等[10]采用超臨界CO2萃取牡丹籽油，結果表明牡丹籽出油率達28.86%，且牡丹籽油的抗氧化性優(yōu)于壓榨法。水酶法是一種安全無污染的提油方法，操作簡單，條件溫和，能較好地保護油的品質(zhì)，具有良好的開發(fā)前景[11]，而且在提油的同時可以得到蛋白和活性肽，對油料綜合利用方面意義重大。目前，有較多研究采用水酶法提取牡丹籽油，如張正周等[12]研究了5種酶(纖維素酶、果膠酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶)的酶解對牡丹籽出油率的影響，在最優(yōu)條件下，牡丹籽出油率達19.08%；李靜等[13]篩選出了堿性蛋白酶作為水酶法萃取牡丹籽油的最佳酶制劑，經(jīng)過工藝優(yōu)化，牡丹籽出油率達23.25%；彭瑤瑤等[14]采用三步酶解、二次破乳的方法，將水酶法提取的牡丹籽油得率提高到25.4%。然而，從現(xiàn)有研究中可以發(fā)現(xiàn)，水酶法發(fā)展至今仍存在瓶頸[15-16]。首先，獲得的油脂是游離油和乳狀液的混合物，所以需要對乳狀液進行破乳，而這種乳狀液是一種高度穩(wěn)定的水包油狀態(tài)，很難完全破碎[17]。其次，水解細胞壁需要很長時間。此外，大量酶的使用導致生產(chǎn)成本較高。

為解決傳統(tǒng)水酶法提取時間長、生產(chǎn)成本高等問題，本試驗擬應用乙醇水溶液輔助酶解提取牡丹籽油，研究確定該工藝下提取牡丹籽油的最佳酶用量、乙醇體積分數(shù)、粒徑等條件，同時利用激光共聚焦顯微鏡分析預處理對牡丹籽的影響，旨在提高牡丹籽油得率的同時降低生產(chǎn)成本、縮短生產(chǎn)周期、保證油品質(zhì)量，并且借助乙醇極強的破乳能力，解決破乳困難的問題，從而為牡丹籽的開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牡丹籽：鳳丹，產(chǎn)自甘肅；

商品油A：壓榨油，A廠家生產(chǎn)；

商品油B：超臨界萃取油，B廠家生產(chǎn)；

中溫α-淀粉酶(480 L型)、葡糖淀粉酶(360 L型)：諾維信有限公司；

其他常規(guī)試劑：AR級，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療機械廠；

搖擺式高速中藥粉碎機：DFY-500型，浙江林大機械公司；

低速離心機：LXJ-IIB型，上海安亭儀器廠；

自動脂肪測定儀：SZC-101型，上海纖檢儀器公司；

激光粒度分析儀：S3500型，美國Microtrac公司；

旋轉蒸發(fā)儀：RV 10型，德國IKA公司；

氣相色譜儀：GC-2010PPLUS型，日本島津公司；

激光共聚焦顯微鏡：LSM 710型，德國蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1 牡丹籽油的提取工藝

牡丹籽→脫殼→酸熱預處理→過濾→烘干→粉碎→酶解→乙醇水溶液提取→離心→冷凍破乳→清油

酸熱預處理參考文獻[18]修改如下：取700 g脫殼牡丹籽加入到5 L燒杯中，按料液比1∶5 (g/mL)加入0.05 mol/L的檸檬酸溶液，于滅菌鍋110 ℃處理0～1 h后過濾，將過濾后的牡丹籽置于60 ℃烘箱烘干5 h。

對烘干的牡丹籽進行粗粉，15 s/次，粉碎4次，再進行精粉，通過控制粉碎次數(shù)得到不同粉碎程度的樣品。粉碎后的牡丹籽經(jīng)兩步酶解、一步乙醇水溶液提取得到牡丹籽油。反應結束后于5 000 r/min離心15 min得到油相、乳狀液相、水相和渣相。收集各相并稱重。乳狀液于-20 ℃冷凍破乳，合并清油，按式(1)計算清油得率。

(1)

式中：

c——清油得率，%；

m——清油質(zhì)量，g；

w——原料重量，g；

F——原料中單位質(zhì)量的脂肪含量，%。

水相含油量表征：采用Rose-Gottlieb法測定水相中單位質(zhì)量的脂肪含量，按式(2)計算含油量。

(2)

式中：

c1——水相含油量，%；

w1——水相質(zhì)量，g；

F1——水相中單位質(zhì)量的脂肪含量，%；

w——原料重量，g；

F——原料中單位質(zhì)量的脂肪含量，%。

渣相含油量表征：濕渣烘干后采用GB/T 5512—2008測定單位質(zhì)量的脂肪含量，按式(3)計算含油量。

(3)

式中：

c2——渣相含油量，%；

w2——渣相質(zhì)量，g；

F2——渣相中單位質(zhì)量的脂肪含量，%；

w——原料重量，g；

F——原料中單位質(zhì)量的脂肪含量，%。

1.2.2 牡丹籽油的簡單精煉

脫酸→水洗→脫色→脫水→精煉油

脫酸：稱取由式(4)計算得到的NaOH量，配制成20%的水溶液加入油中，在70 ℃下攪拌30 min，離心得到脫酸油。

(4)

式中：

M——加堿量，g；

VA——毛油的酸價(以KOH計)，mg/g；

G——毛油質(zhì)量，g。

脫色：向油中添加1%的活性白土，常溫攪拌30 min，抽濾2次。

脫水：將脫色油在60 ℃下，轉速30 r/min，真空旋轉蒸發(fā)2 h，得到精煉油。

1.2.3 分析方法

(1) 牡丹籽成分分析：水分按GB 5009.3—2010執(zhí)行；脂肪按GB/T 5539—2008執(zhí)行；蛋白質(zhì)按GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法執(zhí)行；淀粉按GB/T 5514—2008執(zhí)行；粗纖維按GB/T 5515—2008執(zhí)行；灰分按GB 5009.4—2016執(zhí)行。

(2) 激光共聚焦顯微鏡分析：樣品的固定方法參照Campbell等[19]的進行。尼羅紅和FITC被選為熒光染料，使用10×和20×的物鏡進行觀察。

(3) 粒徑分析：取不同粉碎程度的牡丹籽粉約0.1 g置于10 mL離心管中，加入8 mL去離子水，室溫條件下，漩渦振蕩1 min，混勻。滴加樣品至激光粒徑分析儀樣品池中，測定其體積平均粒徑。

(4) 牡丹籽油品質(zhì)分析：根據(jù)牡丹籽油的糧食行業(yè)標準(LS/T 3242—2014)測定指標。其中溶劑殘留量即乙醇殘留量。取水酶法提取的牡丹籽毛油于旋蒸瓶中，于60 ℃以30 r/min 的轉速旋轉，0～150 min內(nèi)每隔段時間取5.00 g于汽化瓶內(nèi)，立即密封，于4 ℃?zhèn)溆?。參照文獻[20]采用頂空氣相色譜測定乙醇殘留量。

1.2.4 工藝優(yōu)化方案 以牡丹籽油清油、水相和渣相含油量為評價指標，分別探究物料粒徑、中溫α-淀粉酶和葡糖淀粉酶加酶量以及乙醇體積分數(shù)對評價指標的影響。

(1) 物料粒徑：取5份200 g牡丹籽粗粉，取4份牡丹籽細粉6～9次，測定不同粉碎程度的物料粒徑。各取40.00 g不同粉碎程度的牡丹籽采用料液比1∶7 (g/mL)，通過中溫α-淀粉酶(70 ℃，pH 5.5，加酶量2 mL/100 g·原料，反應時間1 h)和葡糖淀粉酶(60 ℃，pH 4.5，加酶量2 mL/100 g·原料，反應時間1 h)酶解，再用體積分數(shù)為35%的乙醇水溶液提取(60 ℃，pH 9.0，反應時間1 h)得到清油。于5 000 r/min離心15 min。離心后測定脂肪含量，以換算到總油百分比。

(2) 中溫α-淀粉酶加酶量和葡糖淀粉酶加酶量：在確定的粉碎粒徑下，調(diào)整中溫α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的加酶量分別為1，2，3，4，5 mL/100 g·原料。其他條件同1.2.4(1)。

(3) 乙醇體積分數(shù)：在確定的粉碎粒徑以及中溫α-淀粉酶加酶量和葡糖淀粉酶加酶量條件下，調(diào)整乙醇體積分數(shù)為0%，15%，25%，35%，45% 5個水平。其他條件同1.2.4(1)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準偏差(n=3)。采用Origin 8.6軟件作圖，通過SPSS 17.0進行ANOVA分析評估顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 牡丹籽主要成分

由表1可知，牡丹籽中粗脂肪含量最高為31.04%，是一種良好的油料作物。蛋白質(zhì)和淀粉含量次之，分別為21.39% 和13.78%。其中淀粉含量較高，淀粉是一種大分子物質(zhì)，水解成糊精后會包裹油分子，使其不能游離出來[21]，對油的提取產(chǎn)生一定影響。

表1 牡丹籽的主要成分及含量

2.2 激光共聚焦顯微鏡分析

分別對110 ℃酸熱處理10，30，60 min的牡丹籽樣品進行激光共聚焦顯微鏡分析，其20×物鏡下的觀察圖像見圖1。10 min處理下的牡丹籽細胞結構飽滿完整，細胞排列緊密，可以看出油仍被蛋白質(zhì)包裹。30 min處理下的牡丹籽細胞由于失水出現(xiàn)明顯皺縮，雖然細胞結構仍然完整，但可觀察到油脂體聚合。經(jīng)過60 min的酸熱處理，部分細胞結構被破壞，油脂體沖出蛋白質(zhì)的包裹范圍，聚集成較大油滴，有利于油脂的提取。當對牡丹籽進行更長時間的酸熱處理時，發(fā)現(xiàn)牡丹籽發(fā)生嚴重的軟化，導致過濾時原料損失。因此，綜合考慮成本、能耗等因素，選擇110 ℃酸熱處理1 h作為乙醇輔助水酶法提取牡丹籽油的預處理條件。

2.3 水酶法提取牡丹籽油的工藝優(yōu)化

2.3.1 粉碎程度對牡丹籽油得率的影響 物料的粉碎粒徑越小，油脂提取率越高[22-23]。原因是物料粉碎粒徑小于本身細胞大小時，細胞壁被充分破壞，細胞內(nèi)油脂易于溶出，同時細胞與提取介質(zhì)的接觸面積擴大。粉碎粒徑過大時，則會有更多的油進入渣相中。

Figure 1 Microstructure of peony seeds under different time of acid-heat pretreatment

不同粉碎程度的牡丹籽平均粒徑與三相油含量分布的關系見圖2。僅經(jīng)過粗粉的牡丹籽粉平均粒徑為130.47 μm，清油得率僅為66.65%，渣相含油量高達20.46%。隨著細粉次數(shù)增加，樣品平均粒徑越來越小，當細粉次數(shù)達到8次時，牡丹籽粉的平均粒徑已經(jīng)降低為33.62 μm，結合圖1結果表明此時粒徑已小于細胞大小，清油得率為90.01%，渣相含油量僅為3.09%。再增加細粉次數(shù)，清油得率不再顯著變化(P>0.05)，此時粉碎粒徑不再是限制提油的關鍵因素。綜合考慮選擇細粉8次作為粉碎程度的較優(yōu)條件。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 中溫α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的加酶量對牡丹籽油得率的影響 預試驗得知中溫α-淀粉酶的最適作用條件為溫度70 ℃，pH 5.5，且作用1 h后對提油率無顯著變化；葡糖淀粉酶的最適作用條件為溫度60 ℃，pH 4.5，反應時間1 h。

表1表明牡丹籽淀粉含量較高，淀粉作為一種大分子物質(zhì)，在溶液中部分水解成糊精，從而包裹油分子，抑制其游離釋放。Mcglone等[24]研究水酶法提取椰子油時得出淀粉酶對油的提取有促進作用。同時，加入葡糖淀粉酶會將被淀粉酶水解后的小分子糖水解為葡萄糖，減小了對油的包裹作用，利于油脂提取。

由圖3、4可以看出，牡丹籽清油得率均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。其原因在于加酶量較少時，酶解不完全，大部分油脂仍存在于物料中，或被大分子蛋白和淀粉包裹不易游離；而加酶量過多時，酶分子間會產(chǎn)生競爭作用，反而降低了酶的作用效率[25]。當加入2 mL/100 g·原料的中溫α-淀粉酶和3 mL/100 g·原料的葡糖淀粉酶于體系中時，清油得率最高為91%左右，渣相油含量可降低至2.5%左右，對油脂的釋放作用達到最優(yōu)。因此確定中溫α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的加酶量分別為2 mL/100 g原料和3 mL/100 g·原料。

2.3.3 乙醇體積分數(shù)對牡丹籽油得率的影響 預試驗得知乙醇水溶液提取牡丹籽油的最適溫度為60 ℃，pH為9.0，反應時間為1 h。如圖5所示，清油得率隨乙醇體積分數(shù)的上升顯著(P<0.05)提高，渣相含油量顯著(P<0.05)減小，水相含油量變化趨于穩(wěn)定。未使用乙醇水溶液時，清油得率僅為74.21%，渣相含油量6.93%；當乙醇體積分數(shù)為35%時，清油得率達到最大(90.08%)，渣相含油量僅為2.78%。表明乙醇水溶液在提油過程中起到了極大的促進作用。這是因為乙醇易溶于水，加入后通過分子運動擴散到油水界面[26]，其強親水性導致蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)改變，乙醇對形成界面膜的表面活性分子的親水端形成吸附力[27]，可以有效破壞界面膜的穩(wěn)定性，促使小油滴聚集，從而提高清油得率；此外，乙醇屬有機溶劑，相似相溶使油脂溶解度增大，促進極性物質(zhì)的溶出[28]，導致渣相含油量下降。但是高濃度乙醇溶液會從物料中提取出膠質(zhì)和多糖，也會增加回收乙醇的能耗[29]。因此選擇體積分數(shù)35%的乙醇輔助提取牡丹籽油。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Effects of the medium temperatureα-amylase dosage on oil distribution in three phases

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 牡丹籽油品質(zhì)分析

2.4.1 牡丹籽油的乙醇殘留 如圖6所示，隨旋轉蒸發(fā)時間的延長，乙醇含量下降呈先快后慢的趨勢。未旋蒸前毛油中的乙醇殘留量較高，達329.7 mg/kg，當旋蒸時間延長至120 min 時，乙醇殘留量下降到6.84 mg/kg，低于牡丹籽油的糧食行業(yè)標準。因此，在60 ℃下旋轉蒸發(fā)120 min可除去油中的大部分乙醇。

2.4.2 牡丹籽油的品質(zhì)指標 乙醇輔助水酶法制備的牡丹籽毛油和精煉油及商品油A、B的品質(zhì)指標見表2、3。通過與牡丹籽油的糧食行業(yè)標準比較，可以看出，水酶法油與2種商品油的特征指標無顯著差異，且均符合標準。其中脂肪酸組成相近，說明乙醇輔助水酶法及其精煉步驟對脂肪酸組成的影響非常小。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

乙醇輔助水酶法制備的牡丹籽毛油和精煉油與商品油的色澤和透明度比較接近，但提取的牡丹籽油經(jīng)過簡單精煉后，酸價低于2種商品油，原因可能在于提取過程中經(jīng)過了熱處理，使牡丹籽中的脂肪酶鈍化，減少了甘油三酯生成游離脂肪酸的含量。同時乙醇輔助水酶法制備的牡丹籽油的過氧化值顯著低于商品油，可能是因為其工藝作用條件溫和，得到的牡丹籽毛油質(zhì)量較好，只需進行簡單的精煉步驟，避免了過氧化值的快速升高。

表2 牡丹籽油的特征指標?

? 同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

表3 牡丹籽油的質(zhì)量指標?

? 同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

3 結論

水酶法是一種綠色環(huán)保的新型油脂提取方法，可用于提取牡丹籽油。采用激光共聚焦微觀結構分析得出適當?shù)乃釤犷A處理有利于細胞結構的破壞、油脂的釋放和提取過程的進行。乙醇輔助水酶法提取牡丹籽油的優(yōu)化條件為：加入料液比1∶5 (g/mL)的0.05 mol/L的檸檬酸溶液110 ℃下處理1 h，物料粉碎8次(粒徑為33.62 μm)，分別用中溫α-淀粉酶(溫度70 ℃，pH 5.5，時間1 h，加酶量2 mL/100 g·原料)和葡糖淀粉酶(溫度60 ℃，pH 4.5，時間1 h，加酶量3 mL/100 g·原料)酶解，再于60 ℃、pH 9.0的條件下用體積分數(shù)35%的乙醇提取1 h。在該條件下，牡丹籽清油得率為(90.08±0.04)%，水相含油量為(6.60±0.35)%，渣相含油量為(2.78±0.26)%。

乙醇輔助水酶法提取的牡丹籽毛油品質(zhì)優(yōu)良，經(jīng)過簡單精煉后的牡丹籽油各項指標均達到一級成品牡丹籽油的糧食行業(yè)標準，表明水酶法在牡丹籽油的提取和應用方面具有廣闊的發(fā)展前景。但應注意到，在乙醇輔助水酶法的工藝中采用的料液比較高，因此水相重量大，下一步應注重對水相甚至渣相的利用，以期達到高效綜合利用的目的。此外，近年來，研究者更多地將水酶法應用于低油料作物中，因此選擇合適的預處理方法破壞細胞結構、使油脂釋放，成為了提高油脂提取率的一個重要因素。

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