磺胺類抗生素對不同革蘭氏陰性菌的毒物興奮效應研究

程逸飛, 曾鴻鵠, 于洋, 王大力, 孫昊宇, 林志芬, 莫凌云,*

1. 桂林理工大學環境科學與工程學院，桂林 541004 2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，同濟大學環境科學與工程學院，上海 200092 3. 環境保護部固體廢物與化學品管理技術中心，北京 100029

Hormesis是指生物體在不同劑量化學物質刺激下產生的、以雙相劑量-反應曲線為特征的一種適應性反應，即有毒化學物質對生物體在高劑量時表現負面影響，但在低劑量時卻表現為有益作用的現象[1]，其中的低劑量通常為低于NOAEL(no observed adverse effect level)的劑量區間[2-3]。Hormesis效應在對毒物有不同敏感性的個體和類型之間有著相似的定量特征[4]，Calabrese和Baldwin[5]將其概括為很小的刺激反應幅度，很窄的刺激反應范圍。最大的刺激反應幅度一般不會超過對照組的2倍。通常情況下，這種反應只比對照組高30%～60%[3]。有文獻中表明，6%的促進率即可認為是hormesis效應[6]。

目前，在各類生物(包括動物、植物、微生物)、各類毒物(包括致癌物和非致癌物)及各類生命現象(包括腫瘤形成、生殖、生長、壽命及代謝等)中都發現了hormesis現象。其范圍幾乎涵蓋了包括重金屬化合物、氰化物、多環芳烴、多氯聯苯、有機砷化合物以及農藥和一些抗生素在內的大量有毒物質[7]。Calabrese[8]由此預測，hormesis效應是一種普遍存在的生物學現象，并呼吁將hormesis模型替代線性模型與閾值模型而作為劑量-效應評價的缺省模型。因此，研究hormesis效應對有毒物質的生態風險評估具有重要意義。

抗生素自發現以來，被大量用于人類醫療保健、動物養殖和農業生產當中，具有種類多、應用范圍廣的特點?；前奉惪股?SAs)作為一種典型抗生素，它的濫用引起的環境問題和耐藥性問題日益受到人們的重視[9-15]。在我們前面的研究中發現，SAs可以對費氏弧菌(Aliivibriofischeri)的發光產生hormesis效應，并且認為可能與其群體感應(quorum-sensing)系統密切相關[16]。群體感應這個術語由Fuqua等[17]在1994年被提出，其定義為當細菌的數量達到一定的密度(quorum)時才能發生的感應現象(sensing)。群體感應最早由美國的Nealson等[18]在A.fischeri中觀察到的，在該細菌中群體感應控制著生物發光現象。直到20世紀90年代的研究發現，類似于發光菌A.fischeri的群體感應現象存在于其他的革蘭氏陰性菌中，如植物腫脹病菌(Agrobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)等[19](如圖1)。

圖1 大腸桿菌和費氏弧菌的群體感應系統注：C6、C8、AinS、AinR、LuxR、LuxI、SdiA、FtsZ分別是信號分子C6、信號分子C8、AinS蛋白、AinR蛋白、LuxR蛋白、LuxI蛋白、SdiA蛋白、FtsZ蛋白。Fig. 1 Quorum sensing system of Escherichia coli and Aliivibrio fischeriNote：C6, C8, AinS, AinR, LuxR, LuxI, SdiA, FtsZ are respectively N-3-oxo-hexanoyl homoserine lactone, octanoyl homoserine lactone, AinS protein, AinR protein, LuxR protein, LuxI protein, SdiA protein, FtsZ protein.

但是不同的革蘭氏陰性菌其QS系統不同。比如典型的革蘭氏陰性菌A.fischeri，它可以通過自身合成信號分子，按照信號分子的不同分為2類：AHL信號分子和AI-2信號分子。其中AHL信號分子根據碳鏈的長度不同分為C6和C8 2種，分別由LuxR/LuxI和AinR/AinS調節，相互作用共同調節A.fischeri的發光[16]。而對于另一種革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichiacoli)，E.coli無法通過自身產生AHL信號分子，但其存在著LuxR蛋白的同源蛋白SdiA[20]，其下游蛋白為FtsZ[21]。外源的 AHL能作用于E.coli的SdiA蛋白，促進下游蛋白FtsZ的表達進而促進細菌的生長[22]。那么具有不同的QS系統的E.coli和A.fischeri，SAs是否對它們都具有hormesis效應呢？

本文以大腸桿菌(Escherichiacoli)為受試生物，選取了4種典型的磺胺類抗生素——磺胺氯噠嗪 (SCP)、磺胺吡啶 (SPY)、磺胺甲氧噠嗪 (SMP)、磺胺多辛 (SDX)為受試化合物，測定了4種抗生素對E.coli的0～24 h 的毒性作用，以OD600作為測試終點進行毒性表征?？疾炝瞬煌瑵舛扰囵B基下磺胺類抗生素對大腸桿菌是否能產生hormesis效應；對比了不同磺胺對同為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌和費氏弧菌的hormesis效應，并基于2種菌的QS系統對hormesis效應產生的機制進行了分析。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑和生物

本實驗所用的4種磺胺類藥物，即SCP、SPY、SMP、SDX均購買自 Sigma-Aldrich Co. LLC (上海)，具體試劑信息如表1。進行毒性測試所用化合物配制使用助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli)MG1655購買自Biovector 生物科技有限公司。

1.2 培養基

Luria-Bertani(LB)培養基的配方如下：1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸膏和1%NaCl，pH調節到7.0～7.2。Mueller-Hinton (MH)培養基，其配方如下：0.3%的牛肉粉、1.75%酸水解酪蛋白和0.15%淀粉，pH調節至7.2～7.4。配好后，放入高壓蒸汽滅菌鍋內121 ℃滅菌21 min。

1.3 抗生素對大腸桿菌生長抑制的測定

大腸桿菌接種到5 mL的LB培養基中，在37 ℃培養至OD600(600 nm 處的光密度)到0.5左右。將此菌液稀釋1×105倍后，加入100孔板中?？装逯忻總€孔按照“80 μL培養基+80 μL藥物+40 μL菌液”的方式配制成200 μL的體系。然后將200孔板放入37 ℃、180 r·min-1的自動檢測儀中，連續檢測24 h的吸光度(600 nm)情況。單一毒性計算方式按照下式：

表1 實驗藥品信息Table 1 Experimental drug information

(1)

式(1)中，Inhibition為第i組實驗濃度下的抑制率；OD600,0為對照組的吸光度；OD600，i為抗生素濃度為i時大腸桿菌的OD600。

1.4 Hormesis效應曲線的擬合

本實驗的擬合模型選用Deng等[23]提出的Hormesis擬合模型，即：

(2)

式(2)中，x表示受試化合物的濃度；m表示效應底值；a表示最低劑量點的中值；b表示a點處的斜率；p表示最高劑量點的中值；q表示p點處的斜率。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 SAs在原倍MH培養基下對E. coli的hormesis效應

為了考察磺胺類抗生素對E.coli的hormesis效應，我們首先測定了磺胺多辛 (SDX)對E.coli的生長的影響，并對實驗組和對照組之間進行了差異顯著性檢驗，在24 h下的劑量-效應曲線和差異顯著性檢驗如圖2所示(實驗組和對照組之間的差異顯著性分別由*(P<0.05)，**(P<0.01)，***(P<0.005)表示。

從圖2可以看出，SDX在原倍MH培養基的條件下對E.coli生長的劑量-效應曲線表現為傳統的S型劑量-效應曲線，在低濃度段沒有表現出顯著的促進作用。但是，Vichi等[24]的研究表明，只有在部分消耗的培養基中，阿霉素對細胞生長才存在hormesis效應。Belz等[25]也發現，銀膠菊堿對萵苣根生長的hormesis效應只發生在低于最大濃度的培養條件下。以此推測，培養基的濃度對E.coli的生長會產生影響，改變培養基的濃度或許會導致SAs對E.coli生長存在hormesis效應。

2.2 SAs在不同濃度MH培養基下對E.coli的hormesis效應

我們考察了在不同濃度培養基條件下(0.4倍、0.6倍、0.8倍MH培養基)SDX對E.coli生長的影響，在24 h下的劑量-效應曲線如圖3所示。

從圖3中可以看出，在0.4MH和0.6MH培養基中，SDX對E.coli的生長均存在顯著的促進作用，SDX對E.coli生長的最大促進率(Emax)約為22.33%；而在0.6倍的MH培養基中，Emax約為17.78%；在0.8倍的MH培養基中，SDX對E.coli的生長促進作用則十分微弱且不顯著。實驗結果表明，通過改變培養基的濃度，SDX對E.coli可以產生hormesis效應。且隨著培養基濃度的減小，產生的hormesis效應逐漸增強，在0.4MH培養基下產生的hormesis效應最強。

圖2 原倍MH培養基下，SDX對E. coli生長的劑量-效應曲線和顯著性檢驗Fig. 2 Dose-response curve and significance test of SDX on Escherichia coli growth under MH medium

圖3 不同濃度MH培養基下，SDX對E. coli生長的劑量-效應曲線和顯著性檢驗注： a、b、c分別為0.8MH、0.6MH、0.4MH下，SDX對E.coli生長的劑量-效應曲線和顯著性檢驗。Fig. 3 Dose-response curves and significance test of SDX on growth of E. coli under different concentrations of MH mediaNote: a, b, c are respectively dose-response curve and significance test of SDX on E. coli growth under 0.8, 0.6, 0.4-fold dilutions of MH media.

除了培養條件外，時間也是決定hormesis是否發生的一個重要因素。Calabrese等[7]指出，hormesis只可能在暴露發生后或發生過程中的某些特定時間發生?？梢?，hormesis效應的產生受到培養條件、時間等多因素的影響，所以這種因培養條件改變而引起horemsis效應改變的現象可能同樣存在于其他的化合物暴露的情況中。

2.3 SAs在0.4MH培養基下對E. coli的hormesis效應

為了進一步驗證SAs對E.coli生長的促進作用是否具有普遍性，接下來我們選取了另外3種SAs對E.coli在0.4MH培養基下進行了實驗，實驗結果如圖4所示。

由圖4可以看出，在0.4MH培養基的條件下，SCP、SPY和SMP對E.coli均存在顯著的促進作用，Emax分別為13.23%、18.72%和15.37%。即在0.4MH培養基的條件下，3種SAs對E.coli均存在hormesis效應，且最大促進率均在10%和20%之間。

那么對于與E.coli具有不同QS系統的A.fischeri，SAs是否對它具有hormesis效應呢？如果有，SAs對E.coli與對A.fischeri的hormesis之間是否存在什么聯系？這樣的聯系能否延伸到所有革蘭氏陰性菌？

圖4 0.4倍MH培養基下，SAs對E. coli生長的劑量-效應曲線和顯著性檢驗注：a、b、c分別為0.4MH培養基下，SCP、SPY、SMP對E. coli的生長劑量-效應曲線和顯著性檢驗。Fig. 4 The dose-response curve and significance test of SAs to E. coli growth under 0.4-fold dilutions of MH mediaNote: a, b, c are respectively dose-response curve and significance test of SCP, SPY, SMP on E. coli growth under 0.4-fold dilutions of MH media.

圖5 SAs對Aliivibrio fischeri發光的劑量效應曲線Fig. 5 The dose-response curve of SAs on A. fischeri luminescence

2.4 SAs對E. coli與對A. fischeri的hormesis效應的比較

為了找到SAs對E.coli與對A.fischeri的hormesis效應之間的聯系，我們對比了本文SAs作用E.coli的實驗結果與前期SAs作用A.fischeri的實驗結果[26](圖5)。

根據圖5可知，6種SAs對A.fischeri的最大促進率達到75%左右，而SAs對E.coli的最大促進率僅為15%左右(圖4)。綜上所述，SAs對E.coli和A.fischeri都存在hormesis效應，但對E.coli的hormesis效應明顯要弱于對A.fischeri的hormesis效應。

同作為革蘭氏陰性菌，是什么導致了hormesis效應上的差異？

檢測終點不同可能是導致hormesis效應差異的重要原因之一[26]。A.fischeri是以其發光值作為測試終點，是分子水平上的檢測；而E.coli是以細菌密度為測試終點，是個體水平上的檢測。兩者相比，發光值作為分子水平上的檢測會更加敏感，這可能導致了2種菌之間hormesis效應上的差異。

除了檢測終點的不同之外，E.coli與A.fischer之間存在著不同的群體感應系統可能是導致hormesis效應差異的另一重要原因。在低劑量時，SAs主要通過以下3個途徑促進A.fischer的發光：1) SAs與LuxR結合，形成LuxR～SA復合物，該復合物啟動細菌的QS現象最終促進A.fischeri發光[23]。2) SAs可以促進LitR蛋白的生成，進而促進luxR的表達，產生更多的LuxR蛋白，促進發光[16]。3) SAs可以促進細菌內LuxI的表達，進而促進細菌體內自誘導物AHL的產生，自誘導物AHL與LuxR蛋白結合，促進下游熒光素酶的表達進而促進A.fischeri發光[27]。

在E.coli中存在著LuxR的同源蛋白SdiA[28]。根據Sun等[29]的研究可知，SAs可以通過作用于E.coli的SdiA蛋白，導致了sdiA mRNA的表達量增加，進而促進了細菌生長。此過程類似于SAs作用于A.fischeri的LuxR/LuxI群體感應系統。但相比之下，A.fischeri的群體感應系統更加復雜，因此可能導致SAs對于A.fischeri的hormesis效應比對E.coli更強。

可見，SAs對于此2類不同的測試生物，不同的測試終點，只要在合適的條件下都可以產生hormesis效應。本研究通過SAs作用A.fischeri和E.coli的0～24 h慢性毒性實驗數據證實了SAs對于這2種不同的革蘭氏陰性菌均存在hormesis效應，進而通過分析2種菌的QS系統，推測在合適的條件下，SAs可以通過作用于QS系統，使所有與A.fischeri和E.coli存在類似的QS系統的革蘭氏陰性菌產生Hormesis效應。本研究的結果為抗生素的生態風險評價提供了依據，并且對未來關于hormesis效應的研究和關于革蘭氏陰性菌的群體感應現象的研究提供實驗依據。

通訊作者簡介：莫凌云(1973-)，女，碩士生導師，副研究員，主要研究方向為混合污染物毒理學。

參考文獻(References)：

[1] 黃璐琦, 郭蘭萍, 張小波, 等. Hormesis 概念、機理及其在中藥研究中的應用[C]. 天津: 2010年中國藥學大會暨第十屆中國藥師周論文集, 2010

Huang L Q, Guo L P, Zhang X B, et al. Hormesis and its application in medicinal plant growth[C]. Tianjin: 2010 China Pharmaceutical Conference and the Tenth Chinese Pharmacists Week Essays, 2010 (in Chinese)

[2] Vandenberg L N, Colborn T, Hayes T B, et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: Low-dose effects and nonmonotonic dose responses[J]. Endocrine Reviews, 2012, 33(3): 378-455

[3] Calabrese E J, Baldwin L A. Hormesis: A generalizable and unifying hypothesis [J]. Critical Reviews in Toxicology, 2001, 31(4-5): 353-424

[4] Calabrese E J, Baldwin L A. Hormesis and high-risk groups[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2002, 35(3): 414-428

[5] Calabrese E J, Baldwin L A. The dose determines the stimulation (and poison): Development of a chemical hormesis database [J]. International Journal of Toxicology, 1997, 16(6): 545-559

[6] Migliore L, Rotini A, Thaller M C. Low doses of tetracycline trigger theE.coligrowth: A case of hormetic response [J]. Dose-Response, 2013, 11(4): 1-12

[7] Calabrese E J, Blain R B. The hormesis database: The occurrence of hormetic dose responses in the toxicological literature[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2011, 61(1): 73-81

[8] Calabrese E J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment [J]. Human and Experimental Toxicology, 2010, 29(4): 249-261

[9] Pei R, Kim S C, Carlson K H, et al. Effect of river landscape on the sediment concentrations of antibiotics and corresponding antibiotic resistance genes (ARG) [J]. Water Research, 2006, 40(12): 2427-2435

[10] Martinez J L. Environmental pollution by antibiotics and by antibiotic resistance determinants[J]. Environmental Pollution, 2009, 157(11): 2893-2902

[11] Jiang L, Hu X, Xu T, et al. Prevalence of antibiotic resistance genes and their relationship with antibiotics in the Huangpu River and the drinking water sources, Shanghai, China [J]. Science of the Total Environment, 2013, 458: 267-272

[12] Karkman A, Johnson T A, Lyra C, et al. High-throughput quantification of antibiotic resistance genes from an urban wastewater treatment plant [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2016, 92(3): 104

[13] Rodriguez-Mozaz S, Chamorro S, Marti E, et al. Occurrence of antibiotics and antibiotic resistance genes in hospital and urban wastewaters and their impact on the receiving river [J]. Water Research, 2015, 69: 234-242

[14] Thiele-Bruhn S, Beck I C. Effects of sulfonamide and tetracycline antibiotics on soil microbial activity and microbial biomass [J]. Chemosphere, 2005, 59(4): 457-465

[15] Karunasagar I, Pai R, Malathi G R, et al. Mass mortality ofPenaeusmonodonlarvae due to antibiotic-resistantVibrioharveyiinfection[J]. Aquaculture, 1994, 128(3): 203-209

[16] You R, Sun H, Yu Y, et al. Time-dependent hormesis of chemical mixtures: A case study on sulfa antibiotics and a quorum-sensing inhibitor ofVibriofischeri[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2016, 41: 45-53

[17] Fuqua W C, Winans S C, Greenberg E P. Quorum sensing in bacteria: The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators [J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176(2): 269

[18] Nealson K H, Platt T, Hastings J W. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system [J]. Journal of Bacteriology, 1970, 104(1): 313-322

[19] De Kievit T R, Iglewski B H. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships [J]. Infection and Immunity, 2000, 68(9): 4839-4849

[20] Ahmer B M M, Van Reeuwijk J, Timmers C D, et al.Salmonellatyphimuriumencodes an SdiA homolog, a putative quorum sensor of the LuxR family, that regulates genes on the virulence plasmid [J]. Journal of Bacteriology, 1998, 180(5): 1185-1193

[21] Fuqua W C, Winans S C, Greenberg E P. Quorum sensing in bacteria: The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators [J]. Journal of Bacteriology, 1994, 176(2): 269-275

[22] Wang X D, de Boer P A J, Rothfield L I. A factor that positively regulates cell division by activating transcription of the major cluster of essential cell division genes ofEscherichiacoli[J]. The EMBO Journal, 1991, 10(11): 3363-3372

[23] Deng Z X, Lin Z F, Zou X M, et al. Model of hormesis and its toxicity mechanism based on quorum sensing: A case study on the toxicity of sulfonamides toPhotobacteriumphosphoreum[J]. Environmental Science and Technology, 2012, 46(14): 7746-7754

[24] Vichi P, Tritton T R. Stimulation of growth in human and murine cells by adriamycin [J]. Cancer Research, 1989, 49(10): 2679-2682

[25] Belz R G, Cedergreen N. Parthenin hormesis in plants depends on growth conditions [J]. Environmental and Experimental Botany, 2010, 69(3): 293-301

[26] Calabrese E J. Hormesis: From marginalization to mainstream: A case for hormesis as the default dose-response model in risk assessment[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2004, 197(2): 125-136

[27] Defoirdt T, Brackman G, Coenye T. Quorum sensing inhibitors: How strong is the evidence? [J]. Trends in Microbiology, 2013, 21(12): 619-624

[28] Whitehead N A, Barnard A M L, Slater H, et al. Quorum-sensing in Gram-negative bacteria [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2001, 25(4): 365-404

[29] Sun H, Ge H, Zheng M, et al. Mechanism underlying time-dependent cross-phenomenon between concentration-response curves and concentration addition curves: A case study of sulfonamides-erythromycin mixtures onEscherichiacoli[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 33718