基于谷胱甘肽結合作用定量研究微囊藻毒素的解毒代謝機制

陳芳梅，陳雋，謝平，李偉,*，于源華，張曉，韓雪榮，于欣冉

1. 長春理工大學生命科學技術學院，長春130022 2. 中國科學院水生生物研究所，武漢430072

微囊藻毒素(microcystin, MC)是由藍藻水華產生的環肽類毒素，廣泛分布于世界各地的富營養化淡水水體中[1-2]。MC主要作為肝毒素，可以通過抑制蛋白磷酸酶1和2A(PP1和PP 2A)上的絲氨酸、蘇氨酸造成嚴重的肝臟損傷。目前，已報道的MC的異構體有100多種。在中國MCRR廣泛分布于淡水湖泊及水產品中，如太湖、巢湖等均有MCRR的檢出[3-5]。MC可以直接污染飲用水源，對水生生物、陸生動物甚至人類健康造成嚴重的威脅。面對MC造成的毒性壓力，亟需進一步深入探討機體內存在的MC解毒代謝機制。

外源性物質(藥物或毒物)在機體內的生物轉化主要是通過Ⅰ相代謝反應、Ⅱ相代謝反應及在此基礎上進一步的處理、降解和排泄。大量研究表明，在Ⅱ相代謝反應中，內源性物質谷胱甘肽(GSH)在MC的解毒代謝過程中發揮著重要作用。Hermansky等[6]報道GSH預處理能夠降低MC對小鼠的毒性損傷。Pflugmacher等[7]通過基質輔助激光解吸電離時間飛行質譜(LC-MALID-TOF)發現在水生動物體內MCLR經谷胱甘肽-S-轉移酶催化與GSH結合，形成中間代謝物MCLR-GSH，繼而進一步代謝為水溶性更強的MCLR-Cys。Takenaka等[8]也通過體外實驗證實了MC可以通過大鼠肝細胞液和微粒體內的GST酶催化形成MC的谷胱甘肽結合物。同時，利用免疫染色的方法Ito等[9]調查了MCLR及其谷胱甘肽結合物在小鼠體內的分布。以上這些研究定性探討了MC在機體內的Ⅱ相代謝反應過程及相應的代謝產物。

運用多級質譜技術(LC-MS/MS)，正離子模式下對MC及代謝物(MC-GSH、MC-Cys)一級質譜全掃描，確定化合物母離子后進行二級質譜掃描獲得該化合物的特征碎片離子，實現動物樣品中MC、MC-GSH及MC-Cys的同時定量分析[10]。，鰱魚、鳙魚等水生動物體內3種物質MC、MC-GSH及MC-Cys定量分析，MC-GSH的濃度在檢測限附近，其濃度遠低于下游代謝物MC-Cys[11-12]。中間代謝物MC-GSH在組織內累積分布的缺失，掩蓋了代謝物MC-GSH向下游代謝轉化的動力學特征，使得MC的谷胱甘肽解毒機制的深入研究更加困難。因此，本研究試圖截斷谷胱甘肽解毒途徑，直接、定向地探討MC-GSH向下游代謝轉化的動力學特征。通過人工合成MCRR的代謝物MCRR-GSH，將該代謝物直接染毒鯽魚和大鼠，利用液相色譜串聯質譜技術定量分析MCRR-GSH在各組織內的累積分布與代謝轉化，深入探討動物體內MC的解毒代謝過程與機制。此外，本研究將從谷胱甘肽解毒的視角為解釋微囊藻毒素對不同動物存在毒性差異提供理論依據，在實踐上對飲用水和水產品安全標準的制定及指導生物體的現場解毒提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 微囊藻毒素及代謝物

微囊藻毒素-RR(MCRR)標準品購自Alexis公司，藻粉來源于云南滇池表面水華藍藻，經干燥、粉碎后，置于-20 ℃冰箱中保存。經甲醇提取、ODS柱富集分離及半制備液相色譜儀分離純化，制備的MCRR的純度大于95%[7]。

L-GSH、L-Cys購自Acros Organics公司，MCRR-GSH和MCRR-Cys的合成方法參考Wu等[10](2010) 和Li等[13](2014)，合成步驟如下：MCRR與L-GSH/Cys在5% K2CO3水溶液中室溫下反應2 h，反應完全后稀鹽酸中和至中性，然后經C18小柱富集分離、半制備液相色譜分離純化，制備的MCRR-GSH及MCRR-Cys結合產物純度均大于95%。

1.2 實驗動物

SD大鼠(7～8周，雄性，體重190～210 g)及大鼠常規飼料購自且大鼠飼養于吉林大學動物實驗中心，環境條件如下：溫度為20～22 ℃，相對濕度為40%～60%，亮暗比為12 h:12 h，。健康的鯽魚(體重250～310 g)購自長春當地的養殖場，在整個馴養和試驗期間，環境條件如下：水溫為(20±1) ℃，pH值為6.6～7.8，溶解氧為(8.2±0.8) mg·L-1，亮暗比為12 h:12 h。

1.3 儀器設備與試劑

液相色譜串聯質譜(LC-MS，美國Thermo)，Waters MCX固相萃取柱(3 cm3·(60 mg)-1, USA)，RE-52A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，Christ RVC 2 —18離心濃縮儀(德國Martin Christ公司)。甲醇、乙腈及甲酸均為色譜純，超純水由Millipore純水機制備，其他試劑均為分析純。

1.4 實驗動物分組與腹腔注射

SD大鼠馴養7 d后，隨機分為實驗組和對照組，每組15條，每個時間點設置3個平行樣。實驗組大鼠腹腔注射MCRR-GSH結合物，劑量1 mg·kg-1體重，對照組腹腔注射同等體積的0.9%生理鹽水。戊巴比妥鈉作麻醉處理，分別于1、6、24、48、72 h收集肝臟和腎臟組織。

鯽魚馴養7 d后，隨機分為實驗組和對照組，每組15條，每個時間點設置3個平行樣。實驗組鯽魚腹腔注射MCRR-GSH結合物，劑量1 mg·kg-1體重，對照組腹腔注射同等體積的0.9%生理鹽水。鯽魚快速解剖并于1、6、24、48、72 h收集肝臟、腎臟和膽囊組織。實驗中所有組織樣品迅速保藏于-80 ℃超低溫冰箱以備用。

1.5 動物組織樣品的制備與檢測

應用冷凍干燥機(Martin Christ，Osterode，Germany)對動物組織樣品進行凍干處理。凍干后的組織樣品中MCRR-GSH和MCRR-Cys提取與分析參考Wu等[10]和Li等[13]建立的方法。實驗步驟如下：凍干樣品磨細后，稱取樣品粉末200 mg，用 5 mL含 0.01 mol EDTA-Na2的5% 乙酸抽提(冰浴超聲萃取)3 次，并在12 000 r·min-1下高速離心10 min，重復提取2次，合并以上3次上清液；將萃取的上清液上MCX小柱，該小柱預先用3 mL的純甲醇活化和3 mL的超純水平衡，分別用3 mL 2%的甲酸水溶液和90%的甲醇淋洗，最后用 10 mL含15%氨水的甲醇洗脫；洗脫液蒸干，用甲醇再溶轉至1.5 mL離心管濃縮蒸干，加入100 μL超純水定容，離心取上清液用于液相色譜串聯質譜法測定。

Surveyor HPLC系統配液相泵、自動進樣器、光電二極管檢測器、離子阱質譜。流動相分別為含0.05%甲酸水(A)—0.05%甲酸乙腈(B)，梯度洗脫程序：0 min (95%A，5%B)，1 min(65%A，35%B)，17 min(55%A，45%B)，17.5 min (30%A，70%B)，18 min(5%A，95%B)，20 min(5%A，95%B)，20.01 min(5%A, 95%B)，25 min (5%A，95%B)。流速為0.2 mL·min-1，HPLC進樣系統內柱溫和樣品盤溫度分別是40 ℃、10 ℃。液相洗脫液在線轉入MS系統，正離子-電噴霧離子化模式，噴針電壓4.5 kV，透鏡電壓45.5 V (MCRR-GSH和MCRR-Cys)，毛細管溫度均為250 ℃。

1.6 組織病理顯微結構的光鏡觀察

將大鼠肝臟和腎臟組織置于福爾馬林緩沖液中固定24 h，依次進行脫水、透明、滲透、石蠟包埋和切片。切片(厚度為4 ～ 5 μm)經蘇木精-伊紅(H&E)染色，Leica光學顯微鏡下觀察。

1.7 數據處理

實驗中所有的結果表示為平均值±標準差(mean ± SD)，用SPSS 17.0統計軟件進行實驗數據的方差分析和組間差異顯著性分析。

2 結果(Results)

2.1 MCRR-GSH及其代謝物MCRR-Cys的LC-MS/MS分析

MCRR-GSH及其下游代謝物MCRR-Cys的化學結構表征，以大鼠染毒1 h的肝臟樣品的LC-MS/MS檢測分析為例，見圖1。正離子-電噴霧離子化模式下(ESI)，MCRR-GSH在色譜柱上的保留時間是9.71 min，以m/z 673.70的二價分子離子峰[M+2H]2+作為母離子進行二級質譜掃描,相應的特征性子離子分別是：m/z 519.86和m/z 609.08。MCRR-Cys在色譜柱上的保留時間是9.89 min，以m/z 580.00的二價分子離子峰[M+2H]2+作為母離子進行二級質譜掃描，相應的特征性子離子分別是：m/z 519.89和m/z 1008.46。對照組實驗動物均未檢測到MCRR-GSH及MCRR-Cys。

2.2 MCRR-GSH在鯽魚肝臟、腎臟及膽汁內的代謝與分布

在鯽魚肝臟、腎臟及膽汁內MCRR-GSH濃度基本在檢測限以上(圖2)。在膽汁內，MCRR-GSH的濃度隨時間呈現逐漸下降的趨勢，并且在暴露1 h時檢測到最大值，濃度為(0.226±0.004) μg·g-1DW。同樣的，腎臟內MCRR-GSH隨時間表現出相同的變化趨勢，1 h累積濃度最大值是 (0.161±0.001) μg·g-1DW。然而，肝臟內MCRR-GSH濃度分布隨時間變化不大。統計學分析顯示：腎臟和膽汁內MCRR-GSH濃度顯著高于肝臟(P< 0.05)，而腎臟和膽汁內MCRR-GSH濃度無顯著差異(P> 0.05)。

圖1 大鼠肝臟內MCRR-GSH和MCRR-Cys的LC/MS/MS分析Fig. 1 LC/MS/MS analysis of MCRR-GSH and MCRR-Cys in the liver of rat at 1 h post-injection of MCRR-GSH

圖2 MCRR-GSH及其代謝物在鯽魚肝臟、腎臟和膽汁內的濃度-時間分布曲線Fig. 2 The concentration-time profiles of MCRR-GSH and MCRR-Cys in liver, kidney and bile of crucian carp after i.p. injection of MCRR-GSH

在鯽魚體內檢測到MCRR-GSH的下游代謝物MCRR-Cys。在72 h的暴露實驗中，肝臟和膽汁內MCRR-Cys的濃度呈現顯著的正相關(r=0.713)，MCRR-Cys的濃度隨時間逐步上升，72 h時濃度均出現最大值。然而腎臟中MCRR-Cys的濃度一直較高，濃度范圍是(0.138±0.014)至(0.247±0.059) μg·g-1DW。腎臟內MCRR-Cys的濃度顯著高于肝臟和膽汁內MCRR-Cys的濃度(P< 0.05)。

圖3 MCRR-GSH及其代謝物在大鼠肝臟和腎臟內的濃度-時間分布曲線Fig. 3 The concentration-time profiles of MCRR-GSH and MCRR-Cys in liver and kidney of rat after i.p. injection of MCRR-GSH

2.3 MCRR-GSH在大鼠肝臟和腎臟內的代謝與分布

大鼠內臟無膽囊器官，本實驗對大鼠的肝臟和腎臟組織內的MCRR-GSH和MCRR-Cys這2種物質的濃度進行檢測分析，結果如圖2所示。

整個72 h的暴露實驗中，肝臟內MCRR-GSH的濃度隨時間呈緩慢下降的趨勢，相鄰時間點間的濃度差基本上相同。而在腎臟中，MCRR-GSH的濃度隨時間表現出較為劇烈的下降趨勢，尤其是在1 h(0.116±0.005 μg·g-1DW)和6 h(0.046±0.005 μg·g-1DW)之間，濃度下降倍數為1.5倍。統計學分析顯示腎臟內MCRR-GSH的濃度顯著高于肝臟(P< 0.05)。

MCRR-Cys在大鼠組織內積累較高的濃度，如圖3B所示。肝臟內MCRR-Cys濃度隨時間波動較大，暴露1 h時檢測到最大濃度值，然而有下降的趨勢。而暴露24 h，MCRR-Cys濃度稍微上升。在腎臟中，MCRR-Cys的濃度變化從(8.899±0.817) μg·g-1DW下降至(3.336±0.263) μg·g-1DW。統計學分析顯示腎臟內MCRR-Cys濃度顯著高于肝臟(P< 0.05)。

2.4 鯽魚和大鼠體內MCRR-GSH 代謝對比分析

在肝臟內，鯽魚體內MCRR-GSH的濃度與大鼠無明顯差異；但鯽魚腎臟內MCRR-GSH的濃度明顯高于大鼠腎臟內MCRR-GSH的濃度。實驗初期，鯽魚肝臟內MCRR-Cys的濃度與大鼠相比無明顯區別，染毒24 h后，鯽魚肝臟內MCRR-Cys的濃度顯著低于大鼠(P< 0.05)；而鯽魚腎臟內MCRR-Cys的濃度在整個實驗中顯著低于大鼠(P< 0.05)。

圖4 MCRR-GSH腹腔注射24 h的大鼠肝臟和腎臟病理組織切片注：對照組肝臟(A)和腎臟(C)，實驗組肝臟(B)和腎臟(D)。Fig. 4 Light microscopy (400×) of representative sections of liver and kidney of rat at 24 h post-injection with MCRR-GSHNote: Liver (A) and kidney (C) from control group; liver (B) and kidney (D) from the MCRR-GSH-treated group.

2.5 肝臟和腎臟組織病理學變化

已有研究表明，微囊藻毒素及其代謝物對大鼠的LD50值明顯低于鯽魚。1 mg·kg-1MCRR-GSH的劑量下，與鯽魚相比，MCRR-GSH對大鼠的毒性作用較大。因此，選擇對MCRR-GSH較為敏感的大鼠進行組織病理學觀察，肝臟和腎臟的組織病理學結果見圖4。與對照組相比，肝臟內未觀察到明顯的組織變化，如細胞空泡化、細胞核固縮或凋亡等；腎臟內也未觀察到明顯的組織損傷變化。

3 討論(Discussion)

本實驗中1 mg·kg-1MCRR-GSH的劑量作用下，鯽魚和大鼠行為正常，并且肝臟和腎臟的組織病理學未觀察到明顯變化。MCRR-GSH的毒性效應幾乎沒有影響到谷胱甘肽解毒途徑的進行。

已有研究表明，動物體內的谷胱甘肽在MC的解毒過程中發揮著重要作用。在肝臟內谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)的作用下GSH與MC發生邁克爾加成反應生成MC-GSH結合物[7,14]。本實驗中，MCRR-GSH經腹腔注射至鯽魚或大鼠后，在各組織內均定量地檢測到該物質，表明MCRR-GSH結合物可以借助動物體內的轉運載體(如oatp/OATP超家族)轉運至各個組織，尤其是腎臟組織[15-16]。雖然MCRR-GSH的降解物MCRR-Cys在各組織內均有分布，但是腎臟中MCRR-Cys的濃度顯著高于肝臟等器官，原因分析如下：1)腎臟內快速地積累了大量的MCRR-GSH結合物；2)MCRR-GSH轉化為MCRR-Cys所需的γ-谷氨酰胺轉移酶和甘氨酸半胱氨酸二肽酶在腎臟中活性最高[17-18]。

實驗初期，鯽魚和大鼠腎臟內的MCRR-Cys濃度均明顯高于肝臟，這一結果定量地證明MCRR-GSH在腎臟內進行代謝轉化的速度非常快。腎臟內的代謝物一方面可通過尿液排泄到體外，另一方面通過血液循環轉運至其他組織或排泄物中[19]。在鯽魚實驗中，腎臟中MCRR-Cys濃度出現上升下降波動趨勢，表明腎臟內MCRR-Cys結合物處于不斷產生和輸出的動態變化中；而肝臟和膽汁內的MCRR-Cys濃度卻呈現出上升的趨勢，表明腎臟內產生的MCRR-Cys通過血液循環輸送至肝臟和膽囊，肝膽循環很有可能是MC的體外排泄的路徑之一。以上研究結果表明，基于谷胱甘肽結合作用MC的解毒代謝過程涉及肝臟和腎臟器官之間的循環合作。

谷胱甘肽對微囊藻毒素的解毒代謝過程推測如下：肝臟內解毒物質GSH經GST酶催化與MC生成中間代謝物MC-GSH，經然后在腎臟內快速轉化為下游代謝物MC-Cys，最后隨尿液和糞便等排泄物排泄至體外。

本實驗中，鯽魚腎臟內MCRR-GSH的濃度明顯高于大鼠，而MCRR-Cys的濃度顯著低于大鼠。這一結果表明，經oatp/OATP超家族轉運，鯽魚腎臟內積累大量的中間代謝物MCRR-GSH，然后在γ-谷氨酰胺轉移酶和甘氨酸半胱氨酸二肽酶的催化下代謝為MCRR-Cys并迅速輸出體外。本實驗定量證明了谷胱甘肽解毒途徑的重要性，并且鯽魚體內谷胱甘肽解毒效率明顯大于大鼠；同時，從解毒的視角為解釋微囊藻毒素對哺乳動物的毒性大于魚類提供了理論依據。目前，根據已報道的化合物(鹵代烷烴、烯烴等)的谷胱甘肽解毒代謝途徑[20-22]，推測MC-Cys很可能進一步乙酰化生成微囊藻毒素-N-乙酰半胱氨酸結合物，該代謝物的水溶性更強，更易于排泄。因此，對于鯽魚體內快速排出的MC-Cys能否進一步乙?；⒛以宥舅卦趧游矬w內最終以何種代謝物的形式排泄至體外等科學問題需要更深入的研究。

通訊作者簡介：李偉(1986-)，女，博士，講師，主要研究方向為水生態毒理學。

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