用SOS/umu試驗評價降雨徑流遺傳毒性的變化

高晶，張肖，趙樂軍，宋現(xiàn)才，金星龍, *

1. 天津理工大學環(huán)境科學與安全工程學院，天津 300384 2. 天津市市政工程設(shè)計研究院，天津 300392

隨著人口的快速增長和城市擴張，城市水資源需求量逐年增大，水資源短缺和水污染日益嚴重，導(dǎo)致城市水資源壓力加劇。近年來，海綿城市研究和建設(shè)使得降雨徑流受到廣泛關(guān)注，并且一些城市已將其作為灌溉和非飲用水水源[1]。但值得注意的是，降雨徑流中污染物通過地表徑流進入城市受納水體，通過物理、化學和生物作用進入水生生物和底棲動物體內(nèi)，通過食物鏈發(fā)生富集和生物放大作用，對水生生物和人類的健康構(gòu)成潛在的威脅[2]。因此，在雨水收集利用中，檢測雨水的污染物毒性是確保雨水安全利用的重要手段之一。

城市徑流中的污染物毒性效應(yīng)及其潛在的生態(tài)影響的研究尚處于起步階段。澳大利亞現(xiàn)有的雨水回收指南只包含一些收集和回收的常規(guī)水質(zhì)參數(shù)的數(shù)據(jù)[3]。而且，雨水的收集研究主要集中在病原體的判斷上，而忽略對有毒的化學物質(zhì)的判斷。即使關(guān)注化學物質(zhì)，大多數(shù)研究也集中在優(yōu)先污染物[4]。近年來，我國也開展降雨徑流毒性的研究，張莉莉等[2]對降雨徑流的毒性、評價方法及評價鑒定進行了綜述，但主要是針對急性毒性的方法介紹，對遺傳毒性的研究較少。

SOS/umu試驗利用可致DNA受損的化學物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生SOS反應(yīng)并產(chǎn)生β-半乳糖苷酶基因與UmuC基因相融合，根據(jù)細菌生成的β-半乳糖苷酶的數(shù)量，即可判斷DNA受損的程度[5]。目前SOS/umu已廣泛用于測試飲用水消毒副產(chǎn)物、自然水[6]和污水處理廠出水[7]的遺傳毒性效應(yīng)。因而采用遺傳毒性研究雨水徑流過程中的生物毒性，對雨水的回收利用有重要的意義。本文通過SOS/umu試驗對不同下墊面降雨過程中不同時間段的雨水樣品進行遺傳毒性測試，分析降雨過程生物毒性的變化趨勢，直觀評價降雨徑流的生物安全性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

試驗菌種為鼠傷寒沙門式菌(Salmonellatyphimurium)TA1535/PSK1002菌株，將已滅菌的20%丙三醇溶液與菌液以1:1的體積比混合，分別裝到1.5 mL的凍存離心管中，每個離心管存放1.0 mL的菌種，放置在-80 ℃冰箱中保存一年。

試驗所用主要儀器：水浴振蕩器(SHA-C，鞏義市予華儀器有限責任公司)、微孔板恒溫振蕩器(HWF200，南京互川電子有限公司)、高壓滅菌鍋(DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械廠)、紫外可見分光光度計(Cary50，美國瓦立安中國有限公司)等。主要試劑：二甲基亞砜(DMSO， ACS級，美國AMERSCO)，4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO，分析純，上海麥克林)，二氯甲烷、甲醇、正己烷(美國BCL， 均為HPLC級)，β-半乳糖苷酶(ONPG，分析純，北京Solarbio)等。

1.2 樣品采集與前處理

2017-05—2017-06期間共采集2場降雨，2場降雨時間均為4 h，降雨強度均為中雨。5月份降雨量為9.8 mm，屋面和道路采集的樣品數(shù)分別為9和3；6月份降雨量為38.6 mm，屋面和道路采集的樣品數(shù)分別為9和6。采樣方法參照《大氣降水樣品的采集與保存》(GB13580.2—92)進行，采樣瓶使用前經(jīng)過5%硝酸浸泡、自來水沖洗、蒸餾水潤洗，分別在屋面的落水管和道路的排水口處進行雨水樣品收集。

降雨初期30 min內(nèi)，每隔10 min采集一次；30～60 min內(nèi)，每隔15 min采集一次；60～120 min內(nèi)，每隔30 min采集一次；2 h以后每隔1 h采集一次直至降雨結(jié)束[8-10]，每次收集4 L雨水樣品，立即運回實驗室。分別用濾紙和玻璃纖維濾膜過濾(GF/F 47 mm，Whatman公司)，然后用OASIS HLB固相萃取柱(500 mg，6 mL，Waters公司)進行富集，萃取柱事先用甲醇、稀鹽酸和超純水活化。富集結(jié)束后，萃取柱分別用10 mL甲醇和15 mL正己烷和二氯甲烷(體積比1:2)進行洗脫并在氮吹儀下吹干至0.9 mL，再用氮氣流吹干，用200 μL DMSO定容，-20 ℃保存。

1.3 SOS/umu試驗

從-80 ℃冰箱取出菌種，用TGA培養(yǎng)基復(fù)蘇，37 ℃隔夜振蕩培養(yǎng)12 h后在無菌操作臺進行轉(zhuǎn)接，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，然后測菌液在595 nm處時吸光度為0.7～0.8。96孔板A中按照不同濃度設(shè)置水樣、陰性對照(DMSO稀釋液)、陽性對照(4-NQO)和空白對照，每組3個平行樣，振蕩培養(yǎng)2 h后轉(zhuǎn)移到提前加入135 μL的培養(yǎng)基B板，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。B板培養(yǎng)期間準備C板，每孔加入120 μL B-buffer，并配制鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)溶液，避光振搖2 h，B板結(jié)束后放入冰箱10 min用酶標儀測定OD595，然后從B板每孔吸取30 μL到C板相應(yīng)位置，并立即加入30 μL ONPG溶液混合振蕩30 min，結(jié)束后加入反應(yīng)終止液120 μL的Na2CO3，放入冰箱10 min用酶標儀測定OD415。

1.4 數(shù)據(jù)處理與計算

SOS/umu測試結(jié)果的計算方法參見文獻[11]：

(1)

(2)

式中，G為生長因子，G大于0.5的數(shù)據(jù)可用于計算IR；IR為誘導(dǎo)率，IR>2可判斷為致突變陽性結(jié)果；A595T、A595B、A595N、A415T、A415B、A415N分別為待測樣品、空白對照、陰性對照在595 nm和415 nm處的吸光度。測試標準系列濃度的陽性參照物系列后，以陽性參照物4-NQO的質(zhì)量為橫坐標，誘導(dǎo)率IR為縱坐標繪制劑量-效應(yīng)曲線，得其方程為y=0.10944x+1(R2=0.9946)。相同實驗條件下測試雨水樣品，繪制水樣的劑量-效應(yīng)曲線，利用2個劑量-效應(yīng)曲線線性擬合斜率的比值，將雨水樣品毒性以4-NQO當量濃度表示，單位為ng·L-1。

2 結(jié)果(Results)

圖1展示了5月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化。從圖1(A)中可知，屋面降雨徑流水樣劑量-效應(yīng)線性擬合斜率隨采樣時間呈降低趨勢。由圖1(B)可知，降雨初期30 min內(nèi)雨水樣品的TEQ4-NQO分別是160 ng·L-1、269 ng·L-1和267 ng·L-1，在10～20 min內(nèi)達到最大，在經(jīng)過降雨初期后，遺傳毒性大幅度下降，30～45 min內(nèi)達到189 ng·L-1。隨著降雨時間的增加，降雨持續(xù)45 min時屋面的大部分污染物已經(jīng)被沖刷，遺傳毒性也隨之逐漸降低，直至降雨結(jié)束達到21 ng·L-1。這表明雨水樣品中的污染物主要來源于下墊面，其大部分污染物主要被初期雨水沖刷，導(dǎo)致初期雨水樣品毒性較大，說明雨水樣品毒性受到屋面污染物影響較大。

圖1 5月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化注：A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當量濃度變化。Fig. 1 Genetic toxicity testing of roof rainfall runoff at different sampling times on MayNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

圖2 5月份不同采樣時間道路降雨徑流的遺傳毒性變化注：A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當量濃度變化。Fig. 2 Genetic toxicity testing of road rainfall runoff at different sampling times on MayNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

5月份道路各采樣時間段降雨徑流的毒性變化如圖2所示。從圖2(A)中可以看出，在道路降雨徑流產(chǎn)生的0.5 h內(nèi)，水樣劑量-效應(yīng)線性擬合斜率先增大后減小。由圖2(B)中可知，TEQ4-NQO先增加后減少，在前20 min內(nèi)從40.1 ng·L-1大幅升高到177.6 ng·L-1，20～30 min時間段內(nèi)從177.6 ng·L-1降為142.1 ng·L-1。圖2與圖1比較得出，5月份道路雨水樣品的遺傳毒性低于屋面雨水樣品的遺傳毒性。

圖3展示了6月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化。圖3(A)為6月份屋面降雨徑流中各時間段雨水樣品的遺傳毒性劑量-效應(yīng)曲線。從圖中可知，在每個時間段內(nèi)隨著雨水樣品含量的增加，水樣劑量-效應(yīng)線性擬合斜率逐漸增大。但隨著降雨徑流時間的持續(xù)，擬合斜率先增大后減小，降雨初期20 min達到最大。與5月份雨水樣品毒性數(shù)據(jù)相比較小，推測可能是由于6月降雨量大，降雨之間的時間間隔較短，污染物的累積量也呈減少趨勢。由圖3(B)與圖1(B)比較，可以得出2場降雨有相似的變化趨勢，在降雨初期30 min內(nèi)達到最大，隨之逐漸降低，但6月份該場降雨在120 min時降雨強度瞬間增大，導(dǎo)致該時間段雨水樣品的遺傳毒性出現(xiàn)小幅度上升，但仍低于初期雨水樣品的毒性，分別為55.0 ng·L-1(120～180 min)、64.7 ng·L-1(180～240 min)。

圖3 6月份不同采樣時間屋面降雨徑流的遺傳毒性變化注: A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當量濃度變化。Fig. 3 Genetic toxicity testing of roof rainfall runoff at different sampling times on JuneNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

圖4 6月份不同采樣時間道路降雨徑流的遺傳毒性變化注：A, 劑量-效應(yīng)曲線；B, 4-NQO當量濃度變化。Fig. 4 Genetic toxicity testing of road rainfall runoff at different sampling times on JuneNote: A, Dose-effect curve; B, 4-NQO equivalent concentrations changes.

6月份道路各采樣時間段降雨徑流的毒性變化如圖4所示，從圖4(A)可知，在10～20 min內(nèi)雨水樣品劑量-效應(yīng)線性擬合斜率最大，然后隨著降雨時間的增加而逐漸減小。圖4(B)也呈相似變化趨勢，在前20 min內(nèi)從121.0 ng·L-1升高到391.3 ng·L-1。

圖5 屋面不同采樣時間段遺傳毒性效應(yīng)曲線Fig. 5 Dose-effect curve of roof runoff of different sampling period

圖6 道路不同采樣時間段遺傳毒性效應(yīng)曲線Fig. 6 Dose-effect curve of road runoff of different sampling period

隨著降雨時間的持續(xù)，降雨強度逐漸減小，TEQ4-NQO也逐漸降低至89.0 ng·L-1。

3 討論(Discussion)

圖5和圖6為屋面和道路降雨過程中遺傳毒性當量濃度的變化趨勢，由于路面從開始降雨至產(chǎn)生徑流需要一定的時間，所以采集樣品的數(shù)量存在差異。由圖中可知：屋面和道路2個下墊面在不同的降雨時期的同一時間段10～20 min 內(nèi)TEQ4-NQO達到峰值，之后有持續(xù)下降的趨勢，反映出下墊面對降雨徑流水質(zhì)的影響在初始沖刷現(xiàn)象最明顯，初期雨水毒性最大。對比2圖可得出：6月份道路雨水樣品的遺傳毒性大于5月份道路雨水樣品的毒性，但是屋面相反，可能是5月份距上次降雨時間間隔大約2個月，屋面污染物聚集多，所以毒性較大；而道路由于定期清掃，受降雨時間間隔和季節(jié)影響不大，因而推測是由于5、6月之間道路進行翻新、溫度升高以及雨水的沖刷作用，導(dǎo)致污染物濃度增大進而雨水樣品的毒性增大。

致謝：感謝中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心魏東斌研究員提供試驗菌株。

通訊作者簡介：金星龍，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為水污染控制及資源化，發(fā)表學術(shù)論文60余篇。

參考文獻(References)：

[1] 鹿新高, 龐清江, 王偉峰, 等. 城市雨水資源化潛力及效益分析與利用模式探討[J]. 水利經(jīng)濟, 2010, 28(1): 1-4

Lu X G, Pang Q J, Wang W F, et al. Potential benefit analysis and utilization mode of urban rainwater resources[J]. Journal of Economics of Water Resources, 2010, 28(1): 1-4 (in Chinese)

[2] 張莉莉, 李飛鵬, 姜月, 等. 城市降雨徑流的毒性及影響因素研究進展[C]. 廈門: 中國環(huán)境科學學會學術(shù)年會, 2013, 5: 4124-4128

Zhang L L, Li F P, Jiang Y, et al. Toxicity and influence factors of urban rainfall runoff [C]. Xiamen: Chinese Society of Environmental Sciences Academic Annual Meeting, 2013, 5: 4124-4128 (in Chinese)

[3] Burton G A, Jr. The role of traditional and novel toxicity test methods in assessing storm water and sediment contamination [J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 2000, 30(4): 413-447

[4] Tang J Y, Aryal R, Deletic A, et al. Toxicity characterization of urban storm water with bioanalytical tools [J]. Water Research, 2013, 47(15): 5594-5606

[5] 趙春桃. 基于生物毒性測試的水質(zhì)安全評價方法及其應(yīng)用研究[D]. 北京: 首都師范大學, 2014: 17-24

Zhao C T. Water quality safety evaluation method based on biological toxicity test and its application research [D]. Beijing: Capital Normal University, 2014: 17-24 (in Chinese)

[6] Lei B, Kang J, Wang X, et al. The toxicity of sediments from Taihu Lake evaluated by severalinvitrobioassays [J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2015, 22(5): 3419-3430

[7] Qian Y W, Yi L, Hong Y H, et al. Removal of genotoxicity in chlorinated secondary effluent of a domestic wastewater treatment plant during dechlorination [J]. Environmental Science and Pollution Research International, 2012, 19(1): 1-7

[8] 黃金良, 杜鵬飛, 李梅香, 等. 澳門城市小流域地表徑流污染特征分析[J]. 環(huán)境科學, 2006, 27(9): 1753-1759

Huang J L, Du P F, Li M X, et al. Characterization of urban surface runoff in two urban catchments in Macau [J]. Environmental Science, 2006, 27(9): 1753-1759 (in Chinese)

[9] 車武, 汪慧珍, 劉紅, 等. 北京城區(qū)屋面雨水污染及利用研究[J]. 中國給水排水, 2001, 17(6): 57-61

Che W, Wang H Z, Liu H, et al. Research on rainwater pollution and utilization in urban roof runoff in Beijing [J]. China Water and Wastewater, 2001, 17(6): 57-61 (in China)

[10] 韓景超, 畢春娟, 呂金剛. 城市不同功能區(qū)徑流中PCBs的污染特征及毒性評價[J]. 中國環(huán)境科學, 2013, 33(3): 546-552

Han J C, Bi C J, Lv J G, et al. Pollution characteristics and toxicological assessment of PCBs in urban runoff [J]. China Environmental Science, 2013, 33(3): 546-552 (in Chinese)

[11] 柳清, 張麗萍, 聶雪彪, 等. umu試驗研究飲用水氯和氯胺消毒過程中遺傳毒性的變化以及消毒條件的影響[J]. 環(huán)境科學, 2010, 31(1): 93-98

Liu Q, Zhang L P, Nie X B, et al. Genotoxicity of drinking water during chlorine and chloramine disinfection and the influence of disinfection conditions using the umu-test [J]. Environmental Science, 2010, 31(1): 93-98 (in Chinese)