納米氧化鋅對凋落物降解微生物群落結構和代謝功能的影響

杜京京，崔明會，張玉燕，郭瑞林，高玉聰，胡丹

1. 鄭州輕工業學院 材料與化學工程學院，鄭州 450002 2. 環境污染治理與生態修復河南省協同創新中心，鄭州450002

納米材料由于具有小尺寸效應、表面效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應等特性，故被廣泛應用于輕工、化工、軍事、醫藥等多個領域[1]。隨著納米科技的飛速發展，越來越多的納米材料被開發并投入到商業應用，如納米銀、納米氧化鋅、納米二氧化鈦、納米氧化鈰等[2]。然而，在研發、生產及應用過程中，納米材料的環境釋放量日趨增加，對生態系統及人體健康存在潛在危害[3]。因此，研究納米材料的生態毒理機制對納米材料的可持續發展及生態安全具有實際意義。

淡水生態系統是大部分生活用水、生產用水及雨水的匯集地[4]，在該系統中，水生絲狀真菌在物質循環和能量流動等方面起著重要的作用。原因在于水生絲狀真菌能夠分泌一系列關鍵的胞外降解酶，作用于系統內的大分子聚合物，對有機質(如凋落物)進行降解轉化，從而使其更容易被碎食性無脊椎動物進食，同時也為水生細菌提供無機營養[5]。在此過程中，水生絲狀真菌完成了將碳和能量從凋落物轉移到更高營養級的生態功能。然而，水生絲狀真菌極易受到外界環境壓力的干擾，如營養來源、溫度、酸堿度、氧氣、重金屬等因素的變化都有可能影響到它的代謝功能，間接地對凋落物的分解效率產生影響[6]。研究表明，重金屬鋅離子和銅離子對水生絲狀真菌的生長繁殖具有抑制作用，從而顯著抑制了其生物活性，導致凋落物降解速率下降[7-8]。然而，納米材料對水生絲狀真菌的影響效應卻鮮有報道[9]，研究水生絲狀真菌對納米材料的響應及適應機制將有助于更好地解釋納米材料對生態系統的環境毒理機制。

納米氧化鋅因其獨特的光電性能、高效的催化能力和抗菌活性而廣泛應用于陶瓷、玻璃、接合劑、涂料、電池和助燃劑等生產中，間接導致了其在水環境中有相當程度的暴露。Nowack課題組和Dumont課題組的研究[10-11]均表明，隨著納米產品的大量應用，預計納米氧化鋅在水環境中的濃度水平將不斷增加。因此，國內外研究者越來越關注納米氧化鋅對生態環境和人類健康造成的負面效應[12-14]。基于上述分析，本課題通過室內模擬凋落物降解過程實驗，探討納米氧化鋅對水生絲狀真菌的影響效應，分析納米氧化鋅在降解過程中的形態變化、運移規律及其對凋落物降解速率的影響；并對體系內水生絲狀真菌生孢率及群落多樣性的變化進行跟蹤，探明水生絲狀真菌在納米氧化鋅作用下的演替規律；結合水生絲狀真菌主要降解酶活性的動態變化，進一步剖析納米氧化鋅的環境行為特征與水生絲狀真菌代謝功能的內在聯系，綜合多重視角來揭示水生絲狀真菌對納米氧化鋅的響應及適應機制，為新興污染物的生態毒理研究提供堅實的理論基礎。

1 實驗材料(Experimental materials)

1.1 納米氧化鋅

實驗所用3種粒徑的納米氧化鋅(30±10 nm，99.9%；90±10 nm，99.8% metals basis；200 nm， 99.9%)均由上海阿拉丁試劑公司提供。納米氧化鋅懸浮液(6 g L-1)的制備：分別稱取不同粒徑的納米氧化鋅粉末，用超純水定容，使用數控超聲波清洗器(KQ-500DE，昆山舒美)在4 ℃、40 KHz條件下超聲30 min使納米顆粒分散均勻。在200 KV下透過電子顯微鏡(JEM-2010，JEOL，日本)表征ZnO懸浮液的初始尺寸和形態特征(圖1)，其平均實際粒徑分別為(15±3) nm、(50±23) nm和 (200±21) nm。

1.2 凋落葉

實驗所用凋落葉取自鉆天楊(PopulusnigralL.)，別稱美楊。由于鉆天楊廣泛分布于河岸兩邊，所以選擇為實驗材料。凋落葉收集于2015年11月濟源硯瓦河的河岸邊，將其帶回實驗室，用去離子水把葉子清洗干凈并用打孔器制成直徑為12 mm的圓盤，40 ℃烘干至恒重(約72 h)，后裝入孔徑為0.5 mm的凋落物袋中(每袋80片，裝之前稱重)，實驗共準備78袋。凋落物袋定植點選在濟源硯瓦河某段溪流(34°56′24.73''N，112°25′56.15''E，海拔134 m，寬度10 m)。該河段水質良好，水溫18 ℃，電導率546μs·cm-1，溶解氧10 mg·L-1，氧化還原電位-60μV，其優勢物種有狹葉香蒲、蘆葦及狐尾藻。將凋落物袋綁緊并系到籠子里，沉浸在河水中15 d使微生物定植。為確定葉片的初始重量，在定植30 min時，隨機選取3袋帶回實驗室烘干并稱重。另外，取20 L河水低溫運送至實驗室用于凋落物培養。

2 實驗方法(Experimental methods)

凋落物定植完成后，將凋落物筐低溫運至實驗室，用純水輕柔清洗葉子3遍后放進裝有60 mL無菌河水(121 ℃，20 min)的150 mL錐形瓶中。其中河水使用隔膜真空泵(LH-85LD，上海昨非實驗室設備有限公司)過濾[15]，并高溫高壓滅菌降至室溫后使用。取15瓶作為空白對照，剩余60瓶進行相應的處理，分別加入納米氧化鋅懸浮液(30、90、200 nm)1 mL，使其最終濃度達到100 mg·L-1[16-20]。實驗采用的是室內模擬的方法，因此需早晚搖三角瓶(光照與黑暗比為12 h：12 h)并記下當時的溫度和濕度，同時溫度在17～18 ℃，為微生物提供適宜的溫度，每隔7天換一次水并重新加入相同濃度的納米氧化鋅。分別在暴露0、4、10、17、27和46 d時取樣，一組15個樣，每個處理3個重復，隨機選取，分別測定真菌生孢率、群落組成、脫氫酶活性、胞外降解酶活性、體系pH值、葉子剩余干重及碳、氮含量等各項指標。

2.1 真菌生孢率及群落組成分析

通過凋落物降解期間葉片上水生絲狀真菌產生的分生孢子來評估真菌生孢率及多樣性。空白組各夾取8片葉子于裝有40 mL河水的錐形瓶中，高壓滅菌(121 ℃、20 min)，作為陰性對照。另從各處理組中各夾取8片葉子置于裝有已滅菌河水的錐形瓶中，加入60μL 0.5% 曲拉通溶液，放入搖床黑暗培養48 h(18 ℃、120 r·min-1)，誘導產生孢子。48 h后，將葉片取出并用5μm混合纖維素濾膜依次過濾每一個錐形瓶中的培養液，然后再用0.05% 乳酸酚棉藍活細胞染液染色并用載玻片固定。20 min后，用400倍光學顯微鏡觀察并記錄真菌分生孢子絲、子囊、孢子形狀和數量，每個樣品觀察20個視野[21-22]。最后所有葉片移入烘箱40 ℃干燥72 h并稱重，根據式(1)計算出生孢率。

生孢率=孢子總數/培養時間

(1)

其中：脫氫酶活性單位表示為個·h-1；培養時間單位為h。

圖1 納米氧化鋅懸浮液的透射電鏡圖注: (a) 30 nm 氧化鋅；(b) 90 nm氧化鋅；(c) 200 nm 氧化鋅。Fig. 1 Transmission electron microscopy (TEM) images of stock suspensionsNote: (a) 30 nm ZnO, (b) 90 nm ZnO, and (c) 200 nm ZnO.

2.2 脫氫酶活性

早期的研究表明脫氫酶活性與生物量之間存在正相關，脫氫酶活性可以間接反映體系內微生物的生物量[23]。本課題根據Hoostal等[24]測定脫氫酶活性的方法，測定凋落葉降解過程中的脫氫酶活性的變化來表征微生物總量的變化。每個處理取3片葉子加入0.4 mL 2,3,5氯化三苯基四氮唑溶液(由Tris 緩沖液配得，pH值為7.6)；在恒溫培養箱中30 ℃黑暗培養24 h后加入4 mL丙酮，繼續培養2 h，搖勻取上清液測485 nm下的吸光度，根據式(2)計算出脫氫酶活性。

脫氫酶活性=CV/Dwt

(2)

其中：脫氫酶活性單位表示為μg TPF·g-1干重；TPF為甲臢化合物；C為濾液中TPF的濃度(由標準曲線得出)；V為凋落物溶液體積；Dwt為凋落物干重。

2.3 胞外降解酶活性

根據Allison實驗室可見光酶標法[25]測定8種胞外酶活性，包括酸性磷酸酶(ACP)，β-葡萄糖苷酶(BG)，纖維二糖水解酶(CBH)，亮氨酸氨基肽酶(LAP)，甘氨酸氨基肽酶(GAP)，多酚氧化酶(PPO)，過氧化物酶(POD)以及N-乙酰-葡萄糖苷酶(NAG)。取10片葉盤放于6 mL醋酸鈉緩沖液中在冰浴中超聲2 min得到酶粗提取液，實驗使用酶粗提取液測定胞外降解酶的活性。其測定方法見表1。

2.4 凋落物損失量及碳氮含量

將每瓶樣品中的葉子用超純水輕洗去殘留的納米氧化鋅，于40 ℃烘干至恒重(約72 h)，用電子天平上(精確度為0.001 g)確定最終干重，凋落葉降解速率根據式Olson提供的公式得出[26]。在降解第0、27和46天時，取凋落葉樣品于90 ℃烘干磨碎，用自動元素分析儀(VARIO EL III, ELemental Analysen systeme GmbH, 德國)測凋落葉在初始、中期和末期的碳氮含量。降解微環境的酸堿度由pH計測定。

3 數據處理與分析(Data analysis)

真菌生孢率、脫氫酶活性、胞外降解酶活性、pH、凋落葉降解速率及中期和后期凋落葉的碳氮含量在各處理間的差異性用單因素方差分析；降解速率率與真菌豐度之間的相關性用Pearson相關系數分析；以上分析用SPSS 18.0版軟件進行了統計分析且結果在5%的顯著性水平；非度量多維尺度分析(NMDS法)用來分析不同處理間水生絲狀真菌群落組成的差異性，且用R語言軟件3.0.2版vegan 安裝包完成。

表1 胞外降解酶活性測定方法Table 1 Determination method of extracellular enzyme activities

4 結果與討論(Results and discussion)

4.1 水生絲狀真菌的生孢率

水生絲狀真菌生孢率受處理組和降解時間的影響(圖2)。小粒徑的納米氧化鋅(30 和90 nm)在前期(前4 d)對其具有抑制作用(圖2，P< 0.05)。然而，分別在第10 天90 nm氧化鋅和第17 天30 nm氧化鋅反而對生孢率起到明顯的促進作用。這反映了經過一定時間的暴露，水生絲狀真菌活性從響應到適應的一個過程。大粒徑的納米氧化鋅(200 nm)經過17 d暴露使水生絲狀真菌的生孢率顯著低于空白組(圖2，P< 0.05)且在之后一直處理較低水平，說明納米氧化鋅的粒徑越大，其對生態過程的抑制作用顯現得越慢[27]。

4.2 水生絲狀真菌的群落組成變化

經過46 d的凋落葉降解，納米氧化鋅的介入使水生絲狀真菌(基于屬水平)群落結構產生了顯著變化(圖3)。如，納米氧化鋅顯著抑制了Astrosphaeriella、Margaritispora、Pestalotiopsis和Massarina在真菌群落中的比例，其中，30 nm氧化鋅對Margaritispora的抑制作用顯著，90 nm氧化鋅對Astrosphaeriella的抑制作用顯著，這表明，真菌群落對不同粒徑的氧化鋅具有不同的響應機制。相反，Ypsilina和Flabellospora在群落中的比例在暴露納米氧化鋅的條件下得到顯著提高，以30 nm 和90 nm的氧化鋅的促進效應最明顯。這表明經過慢性暴露真菌種類對不同粒徑的氧化鋅逐漸顯示出了適應效應。

圖2 納米氧化鋅慢性暴露對水生絲狀真菌生孢率的影響Fig. 2 The impacts of nano-ZnO on aquatic fungal sporulation rate during the chronic exposure

圖3 納米氧化鋅對水生絲狀真菌的群落組成的影響Fig. 3 The impacts of nano-ZnO on community composition of aquatic fungi

圖4 基于水生絲狀真菌生孢率的非度量多維尺度(NMDS)群落組成在納米氧化鋅慢性暴露下的差異Fig. 4 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) analyses performed on sporulation rate of the fungal community present on Populus nigra L. leaf litter

從水生絲狀真菌分生孢子數量角度分析(圖 4)，得出3種水生絲狀真菌的生物量與NMDS1軸有顯著的相關性。其真菌生物量具有以下規律：Alatospora在各處理間的生物量排序為：空白組 < 200 nm氧化鋅 < 30 nm氧化鋅 < 90 nm氧化鋅；Anguillospora和Flabellospora在各處理間的生物量排序為：空白組 > 200 nm氧化鋅 > 30 nm氧化鋅 > 90 nm氧化鋅。這表明Anguillospora和Flabellospora的活性被納米氧化鋅顯著地抑制，且90 nm 氧化鋅抑制作用最強，這可能是由于納米氧化鋅本身或者其釋放的Zn2+所致[28]；另一方面，經過慢性暴露Alatospora的生孢率得以顯著提高，且以90 nm 氧化鋅促進作用最強。

4.3 納米氧化鋅對脫氫酶活性的影響

假設納米氧化鋅具有毒性，那么納米氧化鋅的介入將抑制凋落葉降解過程中的微生物的生物量。實驗結果表明，脫氫酶活性的變化驗證了這個猜想。單因素方差分析顯示，納米氧化鋅對微生物的生物量具有顯著的抑制作用。通過圖5可以看出，納米氧化鋅暴露使脫氫酶活性在前4 d迅速降低，這與我們之前的研究結果類似[9]。其中，30 nm氧化鋅使脫氫酶活性降低了4倍，90 nm氧化鋅降低了2倍，200 nm氧化鋅降低了3倍。對于整個降解周期來說，納米氧化鋅暴露使脫氫酶活性平均值(2.18)比空白對照組脫氫酶酶活平均值(10.40)減少了4倍。暴露在90 nm氧化鋅的凋落物脫氫酶活性的最低平均值為1.83，同期暴露在30 nm 氧化鋅的凋落物脫氫酶酶活平均值為2.12，200 nm 氧化鋅處理組的脫氫酶活性平均值最高為2.59(圖5，P< 0.05)。

4.4 納米氧化鋅對胞外降解酶活性的影響

除了BG、LAP和GAP 3種胞外酶之外，納米氧化鋅的暴露顯著抑制了大部分胞外酶的活性，其中PPO和NAG在整個降解周期中都受到顯著抑制，而30 nm氧化鋅卻對LAP和GAP具有顯著的促進作用(圖6，P< 0.05)。研究表明，納米氧化銅能夠引起氧化應激反應，從而導致水生生物的原生質膜破裂，胞外酶釋放受阻[29-30]。這樣看來，本研究表明納米氧化鋅對水生絲狀真菌產生的胞外降解酶活性具有相似的抑制作用。然而也存在一些例外，在某些采樣期間，200 nm 氧化鋅處理組中ACP、LAP、GAP、POD活性比空白組高，這表明不同胞外酶對納米氧化鋅具有不同的響應機制。

圖5 納米氧化鋅慢性暴露對脫氫酶活性的影響Fig. 5 Changes of dehydrogenase activity during chronic exposure of nano-ZnO

圖6 納米氧化鋅對胞外降解酶活性的影響Fig. 6 The impacts of nano-ZnO on extracellular enzymatic activities

4.5 微環境pH值的變化

在46 d的降解周期中，雖然pH值的變化幅度比較小。但單因素方差分析顯示，納米氧化鋅的暴露使體系內pH值升高，其中30 nm和200 nm氧化鋅處理下pH值顯著升高(圖7，P< 0.05)。然而，在不同粒徑氧化鋅處理之間并無明顯差異。經過46 d降解，空白組體系內pH均值最低為7.52，30 nm 氧化鋅處理組pH均值最高為7.62，其次為200 nm 氧化鋅處理組pH均值為7.59，90 nm氧化鋅處理組pH均值為7.58(圖7)。有研究表明，土壤pH值不受納米氧化鋅介入的影響[31]，我們研究與該研究的不同結果說明了納米氧化鋅在不同介質中產生的影響效應是不同的。這是由于納米氧化鋅的環境行為(如聚集、溶解等)會隨著環境介質的變化而變化[27, 32-34]。因此，研究納米氧化鋅的環境行為有助于更好地解釋其生態毒理機制[35]。

4.6 凋落葉的降解速率

經過46 d的凋落葉降解，空白組的降解速率為0.47，其顯著高于納米氧化鋅處理組(圖8，P< 0.05)，且不同粒徑氧化鋅處理之間也存在著顯著差異(圖8，P< 0.05)。30 nm和90 nm氧化鋅處理下的降解速率(0.28和0.24)顯著低于200 nm氧化鋅處理下的降解速率(0.37)。該結果與納米氧化鈰、納米氧化銅對水體凋落物降解的影響是相同的[36-38]。由于大部分胞外酶被納米氧化鋅所抑制，直接導致水生絲狀真菌對凋落葉的降解速率降低[39]。與真菌生孢率和群落組成等指標相聯系，我們發現Alatospora、Anguillospora和Flabellospora產生分生孢子的數量在各處理間的變化規律與凋落物降解速率具有一致性。其中，Alatospora的生孢率與降解速率具有顯著負相關(R= -0.982，P= 0.018)。這表明以上3種水生絲狀真菌在凋落葉降解過程中起到非常重要的作用，其中Alatospora對降解過程具有抑制作用，而后兩者對該過程起到積極了作用。Alatospora的生孢率與降解速率的顯著負相關表明這種水生絲狀真菌是納米氧化鋅的敏感菌，而Anguillospora和Flabellospora的生孢率在納米氧化鋅介入后顯著增加，表明這2種菌是納米氧化鋅的耐受菌，但需要慢性暴露才能表現出適應機制。

圖7 納米氧化鋅慢性暴露對凋落物降解過程中微觀生態環境pH值的影響Fig. 7 The effect of nano-ZnO on the pH value of microcosms environment during chronic exposure

圖8 納米氧化鋅對鉆天楊凋落葉降解速率的影響Fig. 8 The impacts of nano-ZnO on the decomposition rate of Populus nigra L. leaves litter

4.7 凋落葉碳氮含量的變化

凋落葉降解中期，空白組凋落葉含碳量最高，之后依次是200 nm、30 nm和90 nm 氧化鋅處理組，這表明納米氧化鋅促進水生絲狀真菌對凋落葉有機碳的降解(表2，P< 0.05)，但是在加入納米氧化鋅的處理組之間并無顯著差異。同時，與空白組對比，對于有機氮的降解只有90和30 nm 氧化鋅處理組表現出顯著的促進作用(表2，P< 0.05)。空白組與納米氧化鋅處理組在對凋落葉碳氮比這個指標上并沒有明顯差異，但是30 nm 氧化鋅處理下的凋落葉碳氮比顯著高于200 nm 氧化鋅(表2，P< 0.05)。這表明，30 nm氧化鋅的介入使微生物分泌與氮相關的胞外酶相對于200 nm氧化鋅多，這與凋落物含氮量數據相對應。

凋落物降解末期，90 nm 氧化鋅處理下凋落葉含碳量最高，之后依次是30 nm 氧化鋅、空白組和200 nm 氧化鋅，說明經過納米氧化鋅的慢性暴露對凋落葉中的有機碳的降解沒有顯著的影響，但90 nm 氧化鋅處理下的凋落葉碳含量顯著高于200 nm 氧化鋅(表3，P< 0.05)，這說明長期影響下不同粒徑的納米氧化鋅對水生絲狀真菌有機碳的代謝功能具有差異性。空白組凋落葉含氮量顯著高于納米氧化鋅處理組，且納米氧化鋅處理組之間并無明顯差異性，這說明200 nm氧化鋅在中期時并沒有表現出對有機氮具有顯著的降解作用，但經過慢性暴露其對凋落葉中有機氮的代謝功能表現出顯著的促進作用。因此，慢性或者長期暴露對于評估納米材料生態毒性是非常必要的。這一點在凋落葉碳氮比這個指標上也得到了驗證：納米氧化鋅慢性暴露使末期凋落葉的碳氮比顯著高于空白組，且納米氧化鋅處理組之間并無顯著差異(表3，P< 0.05)。與中期碳氮比結果相比較，表明納米氧化鋅的慢性暴露使水生絲狀真菌在對有機氮的降解功能顯著提高，而對有機碳的降解功能并無明顯影響，從而使處理組的凋落葉碳氮比顯著高于空白組。

表2 凋落葉降解中期碳氮含量Table 2 The content of carbon and nitrogen of Populus nigra L. leaf litter in the medium term of the chronic exposure

注：不同字母表示各處理間存在顯著性差異(P< 0.05)。

Note: Different lowercase letter denotes significant differences (P< 0.05) among treatments.

表3 凋落葉降解末期碳氮含量Table 3 The content of carbon and nitrogen of Populus nigra L. leaf litter in the final term of the chronic exposure

注：不同字母表示各處理間存在顯著性差異(P< 0.05)。

Note: Different lowercase letter denotes significant differences (P< 0.05) among treatments.

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