當歸紅芪超濾物對紫杉醇誘導體外大鼠腎足細胞損傷的保護作用*

朱琳菊，寇煒△，李竺娟，孫少伯，梁冰（.西北民族大學醫學院，甘肅蘭州730030；.甘肅中醫藥大學中西醫結合系，甘肅蘭州730000）

腫瘤是當今世界醫學難題之一，紫杉醇（TAX）為經典抗癌藥物，但其在發揮抗癌作用同時對腎臟具有一定的損傷作用，近年來，隨著中藥產業的發展，對當歸紅芪功效的科學研究日益增多，當歸紅芪超濾物（RASRH）已被證實具有良好的抗腫瘤作用[1-3]。但有關其是否對TAX導致的腎足細胞損傷具有保護作用的文獻報道較少，為此，本研究借助大鼠腎足細胞，采用TAX處理，輔以超濾技術提取純化的RAS-RH干預，利用分子生物學技術，從凋亡角度出發，研究RAS-RH是否對化療藥物損傷的腎足細胞具有保護作用，為其在臨床中的應用提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 大鼠腎足細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所，經甘肅中醫藥大學中西醫結合實驗室傳代培養。

1.1.2 藥物 中藥紅芪、當歸均采自甘肅省岷縣，經甘肅中醫藥大學藥學院生藥學教研室鑒定：紅芪是豆科巖黃芪（hedysarum polybotrys hand?Mazz）屬植物多序黃芪的干燥根莖，當歸為傘形科植物[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根基，RAS-RH參照文獻[4]制作流程和結果，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心與甘肅省膜科學技術研究院聯合制備。

1.1.3 試劑及儀器 倒置相差顯微鏡為日本OLYMPUS產品，Thermo 311二氧化碳培養箱為美國Thermo公司產品，電動離心機為金壇市恒豐儀器廠產品，SCS-24搖床為上海市離心機械研究所產品，精密電子天平為北京賽多利斯儀器系統有限公司產品，高糖培養基、0.5%胰蛋白酶、TrizonX-100、胎牛血清、100X青霉素-鏈霉素溶液均為HyClone公司產品，超凈工作臺、流式細胞儀、16孔細胞電子檢測板（E-Plate）、實時細胞分析（RTCA）儀均為艾森生物-杭州有限公司產品，TAX（E160101）購自上海譜振生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RAS-RH的制備 當歸、紅芪飲片以1∶5的比例混合，水煎煮2次，過濾水煎液并加熱濃縮后用陶瓷膜微濾濃縮液，技術參數為壓力0.2 mPa/m3、溫度25℃、流量10 L/（h·m2）；選用截留相對分子質量為1×105聚丙烯腈（PNA）中空纖維超濾膜，超濾經微濾處理后的當歸、紅芪水煎劑濃縮液，技術參數為壓力5～6 kg/m3、溫度25℃、流量10 L/（h·m2）；將超濾液噴霧干燥成粉，相對生藥材的得率為0.9%[4]。

1.2.2 分組及細胞處理 將大鼠腎足細胞分為對照組、藥物組、TAX組和聯合組。TAX組一次性給予TAX 0.5μg/mL處理24 h，藥物組給予RAS-RH 10μg/mL培養24 h，聯合組先給予RAS-RH 10μg/mL培養24 h后再一次性給予TAX 0.5μg/mL處理24 h。

1.2.3 RTCA 檢測板前4孔加入150μL高糖培養基，后4孔加入150μL RAS-RH，放入RTCA Station中測定基線，保證每孔接觸正常且細胞指數在正常值內。取制備好的大鼠腎足細胞懸液分別以每孔4×103個接種于E-Plate中，在超凈臺中靜置30 min后置于培養箱中的RTCA工作站中，每15分鐘記錄細胞指數，總時長96 h。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 用0.25%胰酶消化收集各組細胞后預冷磷酸鹽緩沖溶液洗滌細胞，在染色緩沖液中5×105/mL重懸細胞，吸取100μL細胞（1×105）至試管中，加入5μL熒光標記的Annexin V（胞內蛋白膜聯蛋白家族成員）和3μL碘化丙啶，混勻后避光室溫孵育15 min，孵育后加入400μL染色緩沖液，用流式細胞儀檢測。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.5統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析、t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TAX對大鼠腎足細胞增殖的抑制作用 TAX組大鼠腎足細胞增殖受到明顯抑制，聯合組大鼠腎足細胞生長明顯優于TAX組。見圖1。TAX對腎足細胞具有較強的生長抑制作用，其抑制程度在一定時間內（72 h）隨作用時間增加而增強；聯合組大鼠腎足細胞生長優于 TAX組，差異有統計學意義（P＜0.05）；TAX處理腎足細胞的半抑制濃度（IC50）值為 4.700μg/mL，24 h后達到最大抑制率。見圖2。

圖1 各組大鼠腎足細胞生長情況比較（倒置相差顯微鏡，200×）

圖2 各組大鼠腎足細胞情況比較（RTCA實時分析）

2.2 RAS-RH對腎足細胞凋亡的影響 除藥物組大鼠腎足細胞凋亡率[（6.24±0.35）%]與對照組[（2.68±0.11）%]比較，差異無統計學意義（P=0.093）外，TAX 組大鼠腎足細胞凋亡率[（20.59±3.74）%]均明顯高于對照組、藥物組、聯合組[（10.59±2.14）%]，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 各組大鼠腎足細胞凋亡率比較

3 討 論

《中國藥典》記載當歸為傘形科植物[Angelica sinen?sis（Oliv.）Diels]的干燥根，具有“補血、活血、調經止痛”等功效[5]。但陳曦等[6]利用陰離子SephadexG-100凝膠柱色譜分離純化當歸多糖，得白色粉末狀多糖APS-bⅡ，采用四甲基偶氮唑鹽法觀察發現，APS-bⅡ對人肝癌HepG2、乳腺癌 MCF-7、宮頸癌 HeLa、結腸癌 SW1116細胞株均具有抑制其生長、增殖的作用。

紅芪為豆科巖黃芪（Hedysayum polybotrys hand?Mass）屬植物，《中國藥典》收載的常用中藥紅芪為多序黃芪的根基，紅芪入藥史載于南北朝梁-陶弘景著的《本草經集注》，具有“扶正祛邪、益氣固本”的功效[5]。李世剛等[7]利用高效色譜得到均一性的紅芪多糖，結果發現，紅芪多糖可明顯抑制人肝癌HepG2、胃癌MGC-803細胞增殖，使G0/G1期比例下降，G2/M期比例升高，增加其凋亡率，其機制可能是通過降低B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）的表達，升高半胱氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）的表達有關。

本研究通過采用倒置相差顯微鏡法和RTCA觀察發現，TAX對大鼠腎足細胞的增殖具有明顯的抑制作用，RAS-RH對TAX導致的損傷具有一定的保護作用。

陳曦等[8]利用RNA干擾技術抑制了胃癌細胞SGC-7901 Bcl-2基因的表達，結果發現，Bcl-2小RNA分子可下調胃癌細胞SGC-7901 Bcl-2基因表達，誘導細胞凋亡，增強 TAX的敏感性，合用TAX、Bcl-2小RNA具有顯著增強協同作用，比任何單獨用藥的細胞凋亡率高。王陽等[9]采用四甲基偶氮唑鹽法檢測了人乳腺癌MCF-7細胞增殖活性，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，結果發現，芹黃素聯合TAX可協同抑制細胞增殖、遷移，誘導細胞凋亡的作用顯著增加。另外，TAX的作用機制獨特且復雜，現在普遍認同的作用機制有以下幾個方面：如微管解聚穩定機制[10]、免疫機制、誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞遷移等。其中可作用于細胞凋亡受體途徑的細胞凋亡膜表面分子通路[11]或激活半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族均可誘導細胞凋亡。段永順[12]認為，TAX可通過將腎癌細胞阻滯在G2/M期，從而起到抑制腎癌細胞增殖的作用。

朱貝貝等[13]通過原代培養大鼠乳鼠心肌細胞，采用X射線照射心肌細胞建立輻射損傷模型，采用不同濃度當歸紅芪多糖進行干預，結果發現，輻射致心肌細胞凋亡的機制之一是線粒體凋亡通路的激活，而當歸紅芪多糖可通過調控凋亡通路起到保護心肌細胞的作用。由此作者聯想到，抗癌藥物TAX對腎足細胞損傷的作用是由于凋亡因子的表達下調機制，而當歸紅芪多糖是否對TAX造成的大鼠腎足細胞損傷也會有類似的保護機制。為此本研究采用倒置相差顯微鏡觀察了大鼠腎足細胞增殖抑制過程，結果發現，TAX組大鼠腎足細胞生長、增殖明顯受到抑制，且細胞生長、增殖曲線與藥物濃度在一定時間內呈依賴關系，流式細胞儀檢測細胞凋亡率為（20.59±3.74）%，RAS-RH聯合TAX可保護TAX造成的大鼠腎足細胞的損傷，聯合組細胞增殖數明顯高于TAX組，同時，細胞增殖抑制曲線也高于藥物組，且TAX組大鼠腎足細胞凋亡率均明顯高于對照組、藥物組、聯合組，差異均有統計學意義（P＜0.05），說明RAS-RH可降低TAX誘導的大鼠腎足細胞凋亡。表明TAX可通過誘導大鼠腎足細胞凋亡，進一步激活凋亡通路造成腎足細胞的損傷；RAS-RH具有抑制細胞基因表達，進一步下調線粒體凋亡通路相關凋亡因子的產生而發揮腎足細胞保護作用。

綜上所述，RAS-RH對TAX誘導的大鼠腎足細胞損傷具有一定的保護作用，其作用機制可能是RAS-RH通過下調大鼠腎足細胞凋亡率而實現的，但RAS-RH如何具體影響凋亡細胞的分子機制尚有待于進一步研究。

[1]劉凱，許茸茸，孫少伯，等.當歸補血湯超濾物對大鼠心肌細胞線粒體凋亡通路的影響[J].中國老年學雜志，2016，36（13）：3115-3118.

[2]李淑玲，劉凱，趙信科，等.當歸紅芪多糖對急性心肌缺血大鼠的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志，2016，22（17）：92-96.

[3]李應東，王博雯，周倩倩，等.當歸紅芪超濾物對自然衰老大鼠抗氧化作用機制的研究[J].時珍國醫國藥，2012，23（6）：1439-1441.

[4]樊秦，李應東，舒暢，等.超濾膜分離純化當歸補血湯的研究[J].中成藥，2010，32（8）：1438-1440.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：124-142.

[6]陳曦，曹蔚，孫陽，等.當歸多糖APS2bII的結構特征及體外抗腫瘤作用[J].科學技術與工程，2013，10（8）：1839-1842.

[7]李世剛，張永琦，趙健雄，等.紅芪多糖體外抗腫瘤活性及構效關系研究[J].中藥藥理與臨床，2013，23（6）：35-37.

[8]陳曦，林振興，林錦娟，等.Bcl-2 siRNA對胃癌細胞凋亡及其紫杉醇敏感性影響研究[J].中華腫瘤防治雜志，2013，20（20）：1580-1584.

[9]王陽，齊慶濤.芹黃素聯合紫杉醇對人乳腺癌MCF-7細胞株增殖、遷移及凋亡的影響[J].華西藥學雜志，2015，30（1）：51-53.

[10]徐晚成.抗癌藥物紫杉醇的作用機理及機制[J].濱州醫學院學報，2017，40（4）：294-297.

[11]杜寧，王猛，張云鋒，等.Nutlin-3和紫杉醇抑制乳腺癌MCF-7細胞株增殖和促進其細胞凋亡的作用和分子機制[J].現代腫瘤醫學，2017，25（24）：3934-3937.

[12]段永順.紫杉醇對腎癌細胞抗癌作用及分子機制的研究[J].世界最新醫學信息文摘，2016，16（72）：270-271.

[13]朱貝貝，暢艷娜，李應東，等.當歸紅芪多糖對輻射損傷心肌細胞線粒體凋亡通路的影響[J].北京中醫藥大學學報，2015，38（12）：811-816.