紅冬蛇菰化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)及其總酚、總黃酮含量測(cè)定*

張聲源，溫正輝，李云霞，林雅立，周 銘△（.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東梅州5403；.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，廣東梅州5403）

紅冬蛇菰（Balanophora harlandii）為蛇菰科（Bala?nophoraceae）蛇菰屬（Balanophora Forst.）多年生肉質(zhì)寄生草本植物，又名為“文王一支筆”和“石蓮花”，主要產(chǎn)于廣東、廣西和云南等省區(qū)[1]。紅冬蛇菰氣味甘苦，無(wú)毒，具有活血化瘀、清熱解毒等功效，民間常用于醒神、治酒積等[2]。我國(guó)是將蛇菰入藥最早的國(guó)家，歷代本草也有記述。其中《本草綱目》有較詳細(xì)記載：“諸名山皆有之，惟太和山采取，云乃葛之精華也。秋霜浮空，如芝、菌涌生地，其色赤脆，蓋罩類(lèi)也。”[3]作者前期對(duì)廣東省梅州市陰那山自然保護(hù)區(qū)進(jìn)行了藥用植物資源調(diào)查，結(jié)果顯示，紅冬蛇菰在該自然保護(hù)區(qū)資源較為豐富，當(dāng)?shù)厝罕姵Ｗ鳛橹参餃现谱魉幧庞糜诜乐翁悄虿『惋L(fēng)濕類(lèi)疾病；此外，由于紅冬蛇菰外形獨(dú)特，與肉蓯蓉較為相似，當(dāng)?shù)匾灿胁糠秩罕姼鶕?jù)“以形補(bǔ)形”中醫(yī)養(yǎng)生理念將其制作為補(bǔ)腎藥酒[4]。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅冬蛇菰的現(xiàn)代化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥理活性等方面的研究鮮有報(bào)道，導(dǎo)致其民間藥用科學(xué)內(nèi)涵等至今尚不明確[5]。本研究首次對(duì)紅冬蛇菰進(jìn)行了化學(xué)成分系統(tǒng)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步確定了其可能含有的化學(xué)成分，以期為紅冬蛇菰植物藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 紅冬蛇菰于2016年10月采自廣東省梅州市陰那山自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室翟明教授鑒定為蛇菰科（Balanophoraceae）蛇菰屬（Balanophora Forst）多年生肉質(zhì)寄生草本植物紅冬蛇菰（Balanophora harlandii）的全草，標(biāo)本存放于嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院天然藥物標(biāo)本館（編號(hào)：20161012）。

1.1.2 試劑 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：10080-200707，純度大于或等于98%），沒(méi)食子酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：110831-200803，純度大于或等于98%），1 N福林-酚試劑購(gòu)自上海金穗生物科技有限公司（批號(hào)：20160117）。甲醇、95% 乙醇、石油醚（60～90℃）、氨水、三氯甲烷、濃硫酸、濃鹽酸、正丁醇、鎂、醋酐、冰乙酸、碘化鉍鉀、硼酸、碘、碘化鉀、磷鎢酸、鐵氰化鉀、三氯化鋁、氫氧化鈉、間二硝基苯、硅鎢酸、三氯化鐵、磷鉬酸、氫氧化鉀、2，4-二硝基苯肼、鹽酸羥胺、乙酸鎂、氫氧化鉀、亞甲基藍(lán)、4-氨基安替比林、亞硝酰、鐵氰化鈉、明膠、3，5-二硝基苯甲酸、鋅粉、對(duì)二氨基苯甲醛、香草醛、氯化鈉、溴酚藍(lán)、茚三酮、酒石酸鉀鈉、氧化鋁、硫酸銅、吡啶、苯甲酸、甲苯、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

1.1.3 儀器 UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司]、JP-100S型超聲波清洗器（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）、BT125D型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）、BS110s型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）、N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）、WJX-A1000型高速多功能粉碎機(jī)（浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 紅冬蛇菰化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn) 按天然藥物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試法進(jìn)行紅冬蛇菰石油醚提取液、乙醇提取液和水提取液的制備，通過(guò)傳統(tǒng)試管預(yù)試方法結(jié)合紙色譜法進(jìn)行揮發(fā)油、油脂、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)、黃酮、蒽醌、香豆素、木質(zhì)素、皂苷、生物堿、甾體、三萜等化學(xué)成分檢測(cè)[6]。

1.2.1.1 石油醚提取液的制備 稱(chēng)取粗粉20 g，置于100 mL三角燒瓶中，加石油醚60 mL，振蕩搖勻，密閉并多次振搖，室溫放置7 d，過(guò)濾，得石油醚提取液，供揮發(fā)油、油脂、甾體、三萜等成分的檢測(cè)。

1.2.1.2 乙醇提取液的制備 用“1.2.1.1”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)后留下的藥材，揮干石油醚，加入95%乙醇100 mL，加熱回流提取1 h，過(guò)濾，濾液分為兩部分：1份為乙醇提取液用作酚類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮、蒽酮、香豆素、內(nèi)酯、強(qiáng)心苷等成分的檢測(cè)；1份經(jīng)減壓濃縮為醇浸膏，取1 g醇浸膏于10 mL試管中，加入2%氯化氫溶液3 mL，超聲溶解，過(guò)濾，得醇浸膏酸水液，用于生物堿的檢測(cè)。

1.2.1.3 水提取液的制備 用“1.2.1.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)后留下的藥材，揮干乙醇，置于200 mL三角燒杯中，加入100 mL蒸餾水，室溫浸泡過(guò)夜，濾取10 mL濾液用于氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。剩余的浸液及藥渣在70℃水浴上熱浸1 h，過(guò)濾，濾液用于糖類(lèi)、多糖及其苷類(lèi)、有機(jī)酸、酚類(lèi)、鞣質(zhì)等成分的檢測(cè)。

1.2.2 總酚含量的測(cè)定

1.2.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 參照文獻(xiàn)[7]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，精密稱(chēng)取干燥至恒重的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，各加入6 mL蒸餾水，再加入0.5 mL福林試劑，充分搖勻避光靜置5 min，再加7.5%碳酸鈉溶液2 mL，用蒸餾水定容至刻度，混勻后在40℃水浴中避光放置60 min，冷卻，于760 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A）值，以沒(méi)食子酸A值為縱坐標(biāo)（Y），沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.2.2 總酚含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取紅冬蛇菰藥材粗粉2.0 g，置于100 mL三角燒瓶中，加入95%乙醇50 mL，室溫超聲提取3次，合并濾液，濾渣洗滌3次，過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液0.1 mL于10 mL棕色容量瓶中，后續(xù)處理方法與“1.2.2.1”項(xiàng)相同，測(cè)定供試品溶液的A值。平行測(cè)定3次。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 參照文獻(xiàn)[8]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，精密稱(chēng)取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，各加水至7 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置4 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置4 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，用60%乙醇稀釋至刻度，放置15 min，在510 nm處測(cè)A值，以試液空白為參比，平行測(cè)定3次。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），A值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.3.2 總黃酮含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取紅冬蛇菰藥材粗粉2.0 g，置于100 mL三角燒瓶中，加入95%乙醇50 mL，室溫超聲提取3次，合并濾液，濾渣洗滌3次，過(guò)濾，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密吸取供試品溶液2.0 mL于25 mL棕色容量瓶中，后續(xù)處理方法與“1.2.3.1”項(xiàng)相同，測(cè)定供試品溶液的A值。

2 結(jié) 果

2.1 化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn) 初步鑒定出供試品溶液可能含有的化學(xué)成分及其類(lèi)型，見(jiàn)表1～3。

表1 紅冬蛇菰石油醚提取液化學(xué)反應(yīng)結(jié)果

表2 紅冬蛇菰乙醇提取液化學(xué)反應(yīng)結(jié)果

表3 紅冬蛇菰水提取液化學(xué)反應(yīng)結(jié)果

2.2 紅冬蛇菰總酚和總黃酮含量 沒(méi)食子酸回歸方程為Y=0.105 6X+0.025 7（R2=0.997 4），表明沒(méi)食子酸含量在0.00～10.01μg/mL內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系；蘆丁回歸方程為Y＝0.013 1X-0.000 3（R2=0.997 6），表明蘆丁含量在0.00～49.26μg/mL內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)回歸方程得紅冬蛇菰中總酚中位體積分?jǐn)?shù)為19.84%，總黃酮中位體積分?jǐn)?shù)為30.42%。見(jiàn)表4。

表4 紅冬蛇菰中總酚和總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

藥用植物在其生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)代謝產(chǎn)生大量骨架結(jié)構(gòu)多樣和生物活性廣泛的活性成分，一直是藥物研究與開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，1981—2014年上市的新藥中超過(guò)1/3直接或間接來(lái)源于天然產(chǎn)物；而在合成藥物中也有相當(dāng)部分借鑒了天然產(chǎn)物的骨架結(jié)構(gòu)或藥效團(tuán)。另有統(tǒng)計(jì)表明，在目前全世界銷(xiāo)售額最高的25種藥品中有10種以上來(lái)源于天然產(chǎn)物或其衍生物[9-10]。

我國(guó)具有豐富的藥用植物、微生物等生物資源，且具有傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論體系，并具有長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。因此，從藥用植物中尋找和開(kāi)發(fā)創(chuàng)新藥物是一條適合我國(guó)新藥研究與開(kāi)發(fā)的途徑。

紅冬蛇菰（Balanophora harlandii）為蛇菰科（Bala?nophoraceae）蛇菰屬植物，主產(chǎn)于廣東、云南等省區(qū)，具有活血化瘀、清熱解毒等功效，梅州市客家地區(qū)民間常用于防治糖尿病、婦科病和關(guān)節(jié)疼痛等病癥[5]。

由于紅冬蛇菰無(wú)人工種植，生長(zhǎng)環(huán)境特殊，采摘周期短，加之宣傳不足。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅冬蛇菰的研究與開(kāi)發(fā)鮮有報(bào)道，其所含活性成分尚不清楚，民間藥用的科學(xué)內(nèi)涵不明確，嚴(yán)重制約了其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)、利用。

本研究首次采用化學(xué)反應(yīng)鑒別方法分別對(duì)梅州市山區(qū)野生紅冬蛇菰的乙醇提取液、水提取液和石油醚提取液進(jìn)行了探討，并通過(guò)多種指示劑和顯色劑的沉淀反應(yīng)或顏色反應(yīng)對(duì)紅冬蛇菰可能含有的化學(xué)成分進(jìn)行了初步分析；采用福林-酚比色法和硝酸鋁絡(luò)合分光光度法分別測(cè)定了紅冬蛇菰乙醇提取物中總酚和總黃酮含量。結(jié)果顯示，紅冬蛇菰中可能含有多糖及其苷類(lèi)、黃酮、酚類(lèi)、鞣質(zhì)、內(nèi)酯、香豆素、甾體、三萜、油脂等多種化學(xué)成分，其中總酚中位體積分?jǐn)?shù)為19.84%，總黃酮中位體積分?jǐn)?shù)為30.42%。

總之，本研究初步確定了紅冬蛇菰中可能存在的化學(xué)成分，并為其化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥理活性及藥物開(kāi)發(fā)的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

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