膿毒癥大鼠早期血管內皮和心肌損害及其相關性研究

郭海雷　盧才教　劉政軍　凌翔偉　胡德林　方林森

[摘要] 目的 觀察早期膿毒癥大鼠模型心臟冠狀動脈內皮與心肌細胞損害情況，探討內皮細胞在心肌損害中發揮的作用。 方法 SD大鼠72只，隨機分為正常、假手術和膿毒癥組，采用盲腸結扎加穿孔術（CLP）制備膿毒癥模型，術后3 h、6 h、12 h和24 h測量心肌力學指標，包括左室收縮峰壓（LVSP）、左室壓力最大上升速率（+dp/dt max）和左室壓力最大下降速率（-dp/dt max），并測量血清內皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、肌鈣蛋白I（cTnI）水平，透射電鏡觀察冠狀動脈內皮細胞和心肌細胞超微結構變化。 結果 膿毒癥組NO和ET-1水平在術后即明顯升高，12 h達峰值；NO和ET-1比值在CLP術后3 h即開始明顯降低，持續低于正常水平。冠狀血管內皮細胞超微結構損傷呈逐步加重，管腔內脫落內皮細胞數目增多，內皮細胞超微結構損傷評分逐步增高。CLP后3 h即出現收縮舒張功能顯著下降，LVSP、±dp/dt max術后6 h達最低；膿毒癥組血清cTnI在術后即明顯升高，12 h時點達峰值；膿毒癥組心肌細胞超微結構顯示肌原纖維、肌漿網、線粒體等損傷逐漸加重，但線粒體數目有增多現象。 結論 膿毒癥早期即存在明顯冠狀動脈內皮損傷，心肌細胞損害和心肌功能障礙，內皮細胞在心肌損害中可能扮演重要角色。

[關鍵詞] 膿毒癥；內皮細胞；心肌細胞；肌鈣蛋白I；內皮素

[中圖分類號] R656.7；R459.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）10-0037-05

Study on the early vascular endothelial and myocardial damage in rats with sepsis and its correlation

GUO Hailei1 LU Caijiao1 LIU Zhengjun1 LING Xiangwei1 HU Delin2 FANG Linsen2

1.Burn and Wound Center，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000，China； 2.Department of Burn Surgery，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，China

[Abstract] Objective To observe the damages of coronary artery endothelium and myocardial damage in the rat model of early sepsis and to explore the role of endothelial cells in myocardial damage. Methods 72 SD rats were randomly divided into normal， sham-operation and sepsis groups. Cecal ligation and perforation（CLP） was used to prepare sepsis model. 3 h， 6 h， 12 h and 24 h after surgery， indices of myocardial mechanics were measured， including left ventricular systolic pressure （LVSP）， maximum increasing rate of left ventricular pressure （+dp/dt max） and maximum decreasing rate of left ventricular pressure（-dp/dt max）. The levels of endothelin 1 （ET-1）， nitric oxide（NO）， troponin I （cTnI） were measured. TEM was used to observe endothelial cells of coronary artery and myocardial ultrastructure changes. Results The levels of NO and ET-1 in sepsis group were increased significantly after operation and peaked at 12 hours； the ratio of NO to ET-1 was decreased significantly at 3 h after CLP， and remained below normal level. Coronary endothelial cell ultrastructure damage was gradually increased， exfoliative endoluminal endothelial cells were increased， and endothelial cell ultrastructure damage score was gradually increased. 3 h after CLP， the systolic and diastolic function was decreased significantly. LVSP， ±dp/dt max reached the lowest at 6 h after operation； serum cTnI in sepsis group was increased significantly after operation and peaked at 12 h. The ultrastructure of myocardial cells in sepsis group showed that the myofibrils， sarcoplasmic reticulum， mitochondria and other damages were gradually aggravated， but there was an increase in the number of mitochondria. Conclusion In the early stage of sepsis， there are obvious coronary endothelial damage， myocardial cell damage and myocardial dysfunction. Endothelial cells may play an important role in myocardial damage.

[Key words] Sepsis； Endothelial cells； Myocardial cells； Troponin I； Endothelin

膿毒癥是指因感染引起機體反應失調而引起致命性多臟器功能障礙，存在循環、細胞和代謝功能異常[1]。膿毒癥和膿毒性休克目前仍是引起死亡的重要原因，每年全球膿毒癥患者數量超過數百萬，約1/4甚至更多患者因此死亡[2]。目前膿毒癥的病理生理學機制尚未完全明確，其中內皮細胞作為炎癥反應的重要靶細胞和效應細胞，其凋亡、脫落、通透性改變，失控性分泌多種細胞因子和炎性物質，引起凝血功能紊亂等在膿毒癥進展中發揮重要作用[3，4]。膿毒癥心功能障礙表現為心肌收縮、舒張功能下降，是一種“功能性”、可逆性改變，是嚴重膿毒癥的常見并發癥，合并心功能障礙患者病死率可達70%～90%，被認為是膿毒性休克患者病死率的獨立危險因素[5]。本實驗采用經典的CLP膿毒癥大鼠模型，通過檢測血清NO、ET-1和cTnI水平，測定心肌力學、透射電鏡下觀察冠狀動脈內皮和心肌細胞細胞核、線粒體、肌原纖維等超微結構變化，深入了解膿毒癥大鼠早期血管內皮、心肌細胞損害和心肌功能障礙情況，探討內皮細胞可能在膿毒癥心肌損害中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 動物分組與膿毒癥模型制備

SD大鼠72只，清潔級，♂♀各半，體重（250±30）g（購于安徽醫科大學動物中心）。SD大鼠染色編號后隨機分正常組（N組）、假手術組（S組）和膿毒癥組（C組），S組和C組又分為手術后3 h、6 h、12 h和24 h四個亞組（S1，S2，S3，S4，C1，C2，C3，C4），每組8只SD大鼠，動物分籠飼養。

使用CLP法復制膿毒癥模型：SD大鼠皮下注射水合氯醛（濃度10%，0.03 mL/kg），麻醉顯效后固定，腹正中線切開約1.5 cm，拉出盲腸，根部絲線結扎，用18號注射針頭貫穿盲腸3次，擠壓盲腸見有糞便流出，回納盲腸后逐層關腹。術后立即在大鼠皮下注射NS 5 mL預防休克。S組大鼠僅行盲腸探查術。

1.2 心肌力學測量

N組在3 h時點，S組和C組在3 h、6 h、12 h和24 h四時點分批用水合氯醛（濃度10%，0.03 mL/kg）麻醉大鼠，固定，頸部去毛后切開皮膚，找到、分離左頸內動脈，將導管置入左心室內，采用生物機能實驗系統（BIOPAC-11A2055型）測量3 h、6 h、12 h和24 h時點的LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max，穩定2 min后記錄數值。心肌力學測定后開腹，從腹主動脈留取血標本待檢測。動物失血死亡后立即開胸取出心臟，切取部分心肌和冠狀動脈置于戊二醛液（濃度2.5%）中固定。

1.3 冠狀動脈內皮細胞和心肌細胞電鏡下觀察

戊二醛溶液固定后的冠狀動脈和心肌組織經包埋、切片后在JEM-1230型透射電鏡下觀察超微結構。

1.4 血管內皮細胞超微結構損傷評分

根據大鼠冠狀動脈血管內皮細胞在透射電鏡下超微結構改變，按照有關文獻[6]稍作改變后對血管內皮細胞損傷程度進行評分，評分標準見表1。

1.5 cTnI、NO和ET-1測定

留取的血標本4000轉/min離心10 min，分離血清放置-80℃冰箱保存。使用酶聯免疫法檢測血清cTnI、ET-1水平，硝酸還原法檢測血清NO水平。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，進行獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清NO、ET-1和內皮細胞超微結構損傷評分的變化

與S組和N組比較，C組血清NO、ET-1術后3 h即持續升高（P<0.01），24 h時點較前略有回落，但仍維持較高水平；NO和ET-1比值CLP術后3 h即開始逐步下降，顯著低于N組和S組（P<0.05）；C組大鼠CLP術后3 h冠狀動脈血管內皮細胞超微結構損傷評分即開始升高，分值逐步增大。見表2。

2.2 心肌力學和血清cTnI變化

與S組和N組比較，C組心肌力學指標（LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max）術后3 h即明顯降低，在6 h達谷底，12 h后有所回升，但仍顯著低于對照組（P<0.05）；C組術后3 h血清cTnI水平持續升高，顯著高于同時點S組與N組（P<0.01），24 h時點有回落趨勢，但仍顯著高于正常水平。見表3。

2.3 冠狀動脈內皮細胞和心肌細胞電鏡下變化

CLP術后3 h 大鼠冠狀動脈血管內皮細胞表現為水腫，輪廓變圓，線粒體也呈現腫脹；CLP術后12 h冠狀動脈血管內皮細胞部分可見核皺縮和染色體邊集，胞內溶酶體數目增加，部分線粒體脊突結構破壞消失，可見部分內皮細胞與血管基膜分離；CLP術后24 h可見較多輪廓不清的冠狀動脈血管內皮細胞，胞內較多線粒體脊突結構消失，出現核固縮和空泡樣改變，冠狀動脈管腔內可見數目較多的凋亡脫落的內皮細胞（圖1～4）。

CLP術后3 h SD大鼠心肌肌原纖維間距離開始逐漸增寬、溶解，肌漿網擴張，線粒體腫脹，隨膿毒癥進展損傷逐步加重，CLP術后24 h心肌肌原纖維結構破壞嚴重，大量肌原纖維斷裂、溶解，并見部分線粒體結構模糊，但數目有增多表現（圖5～8）。

3 討論

目前膿毒癥發病機制尚不完全明確，認為失控性炎癥反應、凝血功能障礙和微血管功能紊亂在膿毒癥病理生理變化中擔當關鍵角色，其中內皮細胞的激活和損傷在膿毒癥發展過程中發揮重要作用[7-9]，是SIRS、MODS、MOF發生發展過程中的關鍵環節之一。關于膿毒癥心功能障礙的病理生理學機制尚不明確，目前研究認為心肌抑制因子、氧化應激、線粒體功能損害、神經內分泌調節障礙、能量異常代謝等方面可能參與膿毒癥心功能障礙的病理生理過程，心肌損害是膿毒性休克患者病死率的獨立危險因素，可影響膿毒癥患者預后[5]。

內皮細胞作為炎癥反應的重要靶細胞因鈣超載損傷而發生凋亡和壞死，內皮細胞與基膜分離、脫落，血管通透性增加，炎性細胞游走到臟器組織，促使組織炎癥反應加重；內皮細胞作為效應細胞分泌多種細胞因子和炎性介質，造成組織器官損傷加重，加速膿毒癥的進程[10-12]。ET-1和NO主要由內皮細胞產生的血管收縮和舒張調節物質，二者分泌失調時可造成嚴重的機體組織缺血缺氧性損傷[13，14]。生理狀態下的NO具有抑制白細胞與血管內皮粘附、抑制血小板凝集、調節內皮素的分泌水平、防止血管收縮痙攣及血栓形成、維持心臟等重要器官的血液灌注等作用[15]。膿毒癥及膿毒癥休克時，機體在炎癥介質、內毒素等刺激下高表達iNOS，產生大量NO，啟動機體內的硝化應激反應，對細胞產生毒性作用，造成肺組織等損傷[15，16]。ET-1對血管平滑肌具有強烈持久的收縮作用，能使機體各種血管發生收縮，尤其是心臟冠狀動脈，其主要表達于內皮細胞。本研究中SD大鼠CLP術后3 h血清NO和ET-1即明顯升高，12 h達到最大值，分別為（123.5±4.2）μg/mL、（148.4±9.7）pg/mL，24 h稍有降低，但仍明顯高于假手術組和正常組（P<0.01），而NO和ET-1比值呈下降趨勢，每時點比值均顯著低于正常組（P<0.05）。實驗結果提示，內皮細胞在膿毒癥狀態下過度產生NO，高表達內皮素，且二者比例失衡，在膿毒癥的發生發展過程中可能起到重要作用，尤其在心肌毒性、心肌缺血缺氧性損傷中可能起關鍵作用；如果能夠有效防治NO和ET-1的過度表達與釋放，將二者調控在合適比例，勢必可能會減輕膿毒癥臟器損害。凋亡的內皮細胞脫落后形成循環內皮細胞，其數量可以直接和特異地反映活體內血管損傷情況[17]。本實驗電鏡下觀察冠狀動脈血管內皮細胞超微結構損傷評分呈逐步升高，內皮細胞呈現水腫，線粒體棘突消失、腫脹，核固縮、空泡樣變化，并逐步加重，最后較多內皮細胞凋亡脫落至管腔內。內皮細胞凋亡、脫落，引起凝血功能紊亂，微循環障礙，累及多系統和臟器，進而導致MODS發生，所以內皮細胞可能是尋找膿毒癥治療的重要靶細胞。

cTnI是較CK、CK-MB敏感性和特異性更高的心肌細胞損傷標志物，cTnI升高水平與膿毒癥的嚴重程度有關，持續性升高預示心功能障礙和不良預后[18]。Cheng H等[19]通過對430例患者的研究認為cTnI是嚴重膿毒癥及感染性休克患者強有力的預測病死率的指標。本實驗顯示膿毒癥大鼠早期就出現cTnI增高，持續高于正常水平，提示膿毒癥初期即存在明顯的心肌細胞結構破壞，實驗中透射電鏡觀察也證實膿毒癥早期心肌細胞超微結構破壞明顯，表現為肌原纖維間距變寬，溶解破壞逐步加重，線粒體出現腫脹、棘突消失，結構模糊等，故而膿毒癥早期采取有效措施減輕心肌細胞損害尤為重要。本實驗中cTnI水平在CLP術后C3達峰值[（1.489±0.260）ng/mL]，之后有所降低，與持續損害的心肌細胞超微結構有差異，cTnI非持續性升高可能與cTnI釋放、降解動態平衡及耗竭有關[20]。LVSP、+dp/dt max、-dp/dt max是反映心肌收縮、舒張功能的敏感指標。本實驗顯示LVSP、+dp/dt max和-dp/dt max在CLP術后3 h即呈現顯著下降，6 h時達到谷底，在12 h后有回升表現，提示膿毒癥初期即存在心肌收縮、舒張功能異常，其可能是“可逆性”功能改變，所以臨床上早期進行心肌保護治療可能對膿毒癥患者預后有益[5]。電鏡觀察膿毒癥時心肌超微結構損害呈逐步加重，而心肌力學并非持續降低，其機制尚不明確，可能與神經內分泌負反饋調節、心肌抑制因子衰減、消耗、心肌線粒體誘生等因素有關[20]。

有研究顯示一些抗炎藥物，如烏司他丁、血必凈等在減輕內皮細胞活化、損害的同時可顯著改善心肌功能，減少心肌細胞損害[21，22]。本實驗結果顯示，膿毒癥早期血清NO、ET-1水平明顯升高，且比例失調的同時，cTnI水平顯著升高，心肌功能下降，透射電鏡下觀察到膿毒癥早期冠狀動脈血管內皮細胞損傷的同時伴有心肌細胞損傷，二者超微結構損害均呈進行性加重，提示膿毒癥狀態下血管內皮細胞和心肌細胞損傷可能相關，內皮細胞可能通過多途徑參與心肌損害，如血管內皮細胞在毒素和失控性炎性細胞因子刺激下誘導NO和ET-1大量表達和釋放，高濃度的NO可對心肌細胞直接產生毒性作用，且二者比例失衡可引起血管痙攣收縮，引起缺血缺氧性心肌損害；凋亡的血管內皮細胞從基底膜脫落，造成膠原暴露，啟動內源性凝血機制，引起凝血功能紊亂、血小板聚集、血栓形成，加重心肌微循環障礙；膿毒癥狀態下內皮細胞損傷和活化，其表面過量表達的黏附分子、選擇素（如VCAM-1、E-選擇素等）誘導白細胞的趨化、黏附和游走，游走至心肌組織的白細胞釋放過量髓過氧化物酶、蛋白水解酶、炎性介質等有害物質可對心肌細胞造成直接損害。

綜上，膿毒癥早期即出現顯著心肌和血管內皮細胞損害，內皮細胞在心肌損害中可能扮演重要角色，其具體機制有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2017-10-08）