SOX30基因調控橋粒基因DSC3抑制肺腺癌的增殖與遷移

馬幫靖，郝翔麟，韓飛，陳洪強，劉晉祎，曹佳， *，張愛華，*

（1．貴州醫科大學公共衛生學院毒理教研室，貴州貴陽550004；2．陸軍軍醫大學軍事預防醫學系毒理學研究所，重慶400038）

肺癌是嚴重威脅人類健康和生命的惡性腫瘤，高居全球男性、發達國家女性癌癥死亡率之首[1]。近年來，我國肺癌的發病率與死亡率已超越其他惡性腫瘤躍升至第1位[2-3]。目前，肺癌發生發展的分子機制尚不十分清楚，對其深入研究有利于改善肺癌的診療及預后。

SOX30基因屬于SOX基因家族的H亞族，在雄性生殖系統發生發育及功能維持中起重要作用[4-5]。本課題組研究[6]發現， SOX30是肺癌中的新抑癌基因，通過轉錄激活p53抑制肺癌細胞增殖、誘導肺癌細胞凋亡，在肺腺癌中的高表達有利于患者預后[7]。最近發現SOX30能夠抑制肺癌轉移，但分子機制尚不清楚。因此，本研究利用基因表達譜數據功能富集分析、轉錄結合位點預測、TCGA數據庫分析篩選SOX30調控的關鍵基因；通過差異表達細胞模型和基因敲除動物模型進一步驗證相關基因的表達；采用平板克隆形成實驗及劃痕愈合實驗分析相關基因在SOX30抑癌中的主要作用，為進一步研究 SOX30基因的作用及臨床應用提供資料。

1 材料與方法

1.1 細胞株及其培養

A549細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，本實驗室前期[6]已將SOX30表達載體轉入A549細胞成功構建過表達SOX30的A549-SOX30穩定轉染細胞系，這些細胞株均使用含10%胎牛血清的F-12K培養液，培養于37℃、CO2體積分數為5%的常規培養箱中，采用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，實驗用細胞為對數生長期細胞。

1.2 SOX30基因敲除小鼠

SOX30基因敲除小鼠品系為C57BL6，委托南京大學模式動物研究所構建，于陸軍軍醫大學實驗動物中心(SPF級)飼養，由本實驗室負責繁殖維護并利用PCR對新生小鼠基因型進行鑒定。

1.3 主要試劑及儀器

F-12K培養基、胰酶、胎牛血清均購自Gibco公司，總RNA提取試劑Trizol Reagent以及pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-DSC3miRNA干擾質粒購自Invitrogen公司， Via FectTMTransfection Reagent(E4982)轉染試劑盒、GoScriptTM逆轉錄試劑盒(A5001)及2×Taq PCRMix購自Promega公司，殺稻瘟菌素(Blasticidin)購自Sigma公司，普通RT-PCR儀購自美國Bio-Rad 公 司，化學發光凝膠成像系統購自英國Syngene公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 SOX30蛋白調控基因功能富集分析基于我們前期獲得的SOX30差異表達細胞系表達譜數據[6]，使用Gene Spring Software11.0(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，US)軟件進行數據處理，采用兩樣本t檢驗篩選差異表達基因，顯著差異表達基因 的 閾值設定為差異倍數≥2且 P <0.05，隨后于網站http://www.geneontology.org/在線對差異基因進行基因功能富集分析(GO enrichment analysis)，獲得關聯的主要通路及相關基因的功能。

1.4.2 DSC3啟動子區SOX30蛋白結合位點預測采用JASPAR數據庫(http://jaspar.binf.ku.dk/)在線預測DSC3(desmocollin3)啟動子區SOX30蛋白結合位點。

1.4.3 臨床標本數據來源及熱圖繪制肺癌組織中SOX30與 DSC3基因的表達數據于UCSC Xena(https://xenabrowser.net)下載，二者數據集ID均為TCGA.LUNG.sampleMap/HiSeqV2；通過提取并進行相應的數據匹配獲得具有 SOX30、DSC3基因表達信息的肺癌及癌旁組織共1129例，其中肺腺癌及癌旁組織576例，肺鱗癌及癌旁組織553例。肺癌組織及癌旁組織中SOX30與DSC3基因的表達熱圖在網站https: //genome-cancer.ucsc.edu/proj/site/hgHeatmap/在線繪制。

1.4.4 DSC3miRNA干擾細胞模型的構建SOX30差異表達細胞模型來源于前期構建[6]的穩定表達pIRES2-EGFP-SOX30質粒(A549-SOX30)和對照質粒(A549-Vector)。按每孔3.0×105個細胞接種A549-SOX30于6孔板，37℃、CO2體積分數為5%條件下培養過夜；參照Via FectTMTransfection Reagent(E4982)轉染試劑盒說明書配制pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-DSC3miRNA轉染復合物，按每孔200μL分別加至6孔板中，搖勻后于37℃、CO2體積分數為5%的常規培養箱中繼續培養，48 h后換用含3μg/mL殺稻瘟菌素的F-12K完全培養液篩選細胞，直至出現熒光陽性克隆；挑取熒光陽性克隆，擴大培養，獲得A549-SOX30+DSC3miRNA穩定表達細胞系并用于后續分析。

1.4.5 細胞與組織的總RNA提取及cDNA合成細胞株總RNA的抽提參照Trizol(Invitrogen)試劑使用說明書進行，并采用Nano Drop分光光度計測定所提總RNA的濃度和純度，然后參照GoScriptTM逆轉錄試劑盒(A5001)使用說明書合成cDNA。 SOX30基因敲除小鼠肺組織首先進行液氮研磨，之后參照上述方法提取總RNA并合成cDNA。

1.4.6 逆轉錄PCRSOX30引物，上游序列5′-GATG TCCCGCTCACCGTGTTGC-3′，下游序列5′-GACAGGG CTTGGGCTCTGGACT-3′；DSC3引物，上游序列5′-GACCCTCGTGATCTTCAGTCG-3′，下游序列5′-TCAC TTGACCGGATGAGGTCT-3′；內參基因 β -actin引物，上游序列5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACGG-3′，下游序列5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′。逆轉錄PCR反應體系(20μL)包括：上、下游引物各1μL，2×Taq PCRMix10μL，cDNA模板1μL，Nuclease-free水7 μL。擴增程序為：95℃、3min；94℃、30s；58℃、30s；72℃、30s；72℃、10min；33個循環。擴增結束后，各取10μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后使用凝膠成像系統進行曝光分析，拍照并保存圖片。實驗重復3次。

1.4.7 平板克隆形成實驗按每孔200個細胞接種A549-Vector、A549-SOX30、A549-SOX30+DSC3miRNA穩定轉染細胞于6孔板，搖勻后于37℃、CO2體積分數為5%的常規培養箱中，用含3μg/mL殺稻瘟菌素的F-12K完全培養液培養2周，直至出現肉眼可見的克隆時，終止培養，取出細胞，PBS清洗細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定30min；結晶紫染色5min；PBS清洗細胞2次，空氣中干燥；拍照保存，分析結果。

1.4.8 細胞劃痕實驗分別將A549-Vector、A549-SOX30、A549-SOX30+DSC3miRNA穩定轉染細胞系按每孔5×105個細胞接種于6孔板中，搖勻后于37℃、CO2體積分數為5%的常規培養箱中培養；待細胞鋪滿皿底(融合度>90%)，用10μL槍頭在6孔板中劃痕，PBS清洗細胞2次；然后加入無血清的F-12K培養液繼續培養，于劃痕后0、48h在同一位置利用倒置顯微鏡進行拍照；統計分析細胞遷移情況。

1.5 統計分析

采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計量資料均采用x±s 表 示，兩樣本均數比較采用成組t檢驗，肺癌中SOX30與DSC3基因表達的相關性分析采用Spearman秩相關分析。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 SOX30轉錄調控基因全基因組表達譜數據功能富集分析

為了尋找 SOX30基因抑制腫瘤的可能下游通路，我們首先對 SOX30基因差異表達細胞系基因芯片數據進行了功能富集分析(GO分析)，結果發現SOX30廣泛與黏著斑(focal a dhesion)、錨定連接(anchoring junction)、黏著連接(adherens junction)、細胞連接(cell juncion)、細胞骨架(cytoskeleton)等在腫瘤侵襲和轉移中具有關鍵調控作用的細胞連接相關基因表達顯著相關，提示SOX30抑癌功能發揮可能與細胞黏附相關通路有關(見圖1)。

圖1 基于SOX30轉錄調控基因表達譜經功能富集分析潛在的下游通路

2.2 生物信息學預測發現 SOX30基因可能調控DSC3基因的表達

為了進一步明確哪些細胞間連接相關基因可能受SOX30蛋白的調控，我們利用JASPAR數據庫(http://jaspar.binf.ku.dk)對SOX30蛋白潛在的轉錄調控基因進行了在線預測，結果發現在 DSC3基因啟動子區存在多個SOX30蛋白結合位點(見表1)，提示SOX30很可能調控DSC3的表達。

表1 DSC3啟動子區 SOX30蛋白結合位點預測

2.3 TCGA數據庫分析 SOX30與 DSC3基因在肺腺癌中表達的相關性

DSC3是一種鈣依賴性糖蛋白，與腫瘤細胞增殖、集落形成、侵襲和遷移等調控有關。由此我們推測SOX30基因的抑癌作用可能與DSC3有關。為了進一步明確SOX30與DSC3在肺癌中的潛在調控關系，我們利用TCGA數據庫分析了 SOX30基因與 DSC3基因在非小細胞肺癌中表達 的 相關性，結果發現二者在非小細胞肺癌中表達無明顯相關(見圖2A)。由于前期研究[7]表明SOX30主要在肺腺癌中發揮作用，為此我們進一步分析了二者在肺腺癌和肺鱗癌中的表達相關性，結果顯示二者在肺腺癌中表達正相關(見圖2B)，在肺鱗癌中表達無明顯相關(見圖2C)，提示二者在臨床肺腺癌中存在調控關系。

圖2 SOX30 與 DSC3基因在 TCGA數據庫肺癌中的表達及相關性分析

2.4 SOX30蛋白是 DSC3基因轉錄調控的關鍵分子

為進一步確證 SOX30 與 DSC3基因之間的調控關系，我們分析了SOX30差異表達細胞系中DSC3的表達， SOX30基因高表達的A549-SOX30細胞中DSC3 mRNA表達也顯著上調(見圖3)，說明 SOX30基因能夠調控 DSC3基因的表達，但是這種調控是不是必須的呢？為此，我們利用 SOX30基因敲除動物模型，使用逆轉錄PCR檢測了野生型(SOX30+/+) 、雜合子(SOX30+/-)以及純合子(SOX30-/-)小鼠肺組織中DSC3mRNA 的 表達情況，結果顯示純合子(SOX30-/-)小鼠肺組織中DSC3 mRNA表達水平顯著低于雜合子(SOX30+/-)及野生型(SOX30+/+)小鼠(見圖4)，表明SOX30蛋白是調控 DSC3基因表達的關鍵分子。

圖3 各細胞中SOX30與 DSC3mRNA 的表達

2.5 SOX30蛋白對A549細胞的集落形成抑制依賴于DSC3基因的表達

圖4 SOX30基因敲除小鼠肺組織中SOX30與DSC3m RNA 的表達

為確定 DSC3基因是否參與SOX30蛋白抑制肺癌細胞增殖的過程，我們進行了克隆形成實驗。結果顯示，過表達SOX30的A549-SOX30細胞集落形成數較對照A549-Vector細胞顯著降低，表明SOX30高表達抑制腫瘤細胞集落形成，而在A549-SOX30+DSC3miRNA細胞中， DSC3基因的表達被干擾后細胞集落形成數較A549-SOX30細胞顯著增加(見圖5)。這提示 SOX30基因抑制腫瘤細胞增殖的作用依賴于 DSC3基因的表達。

圖5 干擾DSC3基因表達減弱SOX30基因對 A 549細胞集落形成的抑制

2.6 SOX30基因對A549細胞的遷移抑制依賴于DSC3基因的表達

由于DSC3是橋粒關鍵構成蛋白，為探索 DSC3基因是否參與了 SOX30基因對腫瘤轉移的抑制，我們利用劃痕愈合實驗分析表明，過表達SOX30的A549-SOX30細胞相對遷移率較對照A549-Vector細胞顯著降低，表明SOX30高表達抑制腫瘤細胞遷移；而在A549-SOX30+DSC3miRNA細胞中，即 DSC3基因的表達被干擾后顯著減弱 SOX30基因對A549細胞遷移的抑制作用，細胞遷移率較A549-SOX30細胞顯著升高(見圖6)。這提示SOX30基因抑制腫瘤轉移與DSC3高度相關。

圖6 干擾DSC3基因表達減弱 SOX30基因對 A 549細胞遷移的抑制

3 討論

脊椎動物細胞間連接主要有黏著連接(adherens junction，AJ)和橋粒(半橋粒)兩種類型。橋粒(desmosome)在細胞間信息交流、細胞定位、細胞形態、細胞結構和組織機械張力等調控中起著重要作用[8-9]。腫瘤細胞局部浸潤必要步驟就是原發腫瘤細胞失去細胞間連接，包括黏著連接和橋粒結構的分解和調控[10]。多項研究表明，橋粒相關蛋白參與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移等過程，在腫瘤的發生發展中起重要作用[11]。近年研究發現，轉錄因子對橋?；虻霓D錄激活是橋?；虮磉_調控的一種重要途徑[12-16]。SOX30是典型的轉錄因子，作為一個新的抑癌基因，在肺癌的發生中起著重要作用，但是相關的機制還不清楚。本研究對SOX30差異表達基因進行了功能富集分析，發現SOX30基因的功能主要與黏著斑、錨定連接、黏著連接等細胞連接信號通路顯著相關，同時通過轉錄結合位點分析發現橋粒關鍵基因 DSC3可能受SOX30蛋白的轉錄調控。 DSC3基因定位于人類染色體18q12.1，編碼產物含896個氨基酸多肽。DSC3蛋白是一種鈣依賴性糖蛋白，且是鈣黏蛋白超家族的橋粒子家族的成員，可與其他家族成員相互作用而促成細胞橋粒介導的細胞黏附[17]。多項研究表明，DSC3在多種腫瘤中表達下調，包括結直腸癌[18-20]、前列腺癌[21]和乳腺癌[22]。Cui等[14]研究發現DSC3是肺癌中一個新的抑癌基因，它可以抑制肺癌的增殖、侵襲和遷移。我們推測SOX30基因可能通過轉錄調控DSC3而發揮抑癌功能。為此，我們進一步利用差異表達細胞模型和基因敲除動物模型驗證，結果發現，過表達SOX30后顯著上調A549細胞中DSC3mRNA 的 表達，敲除 SOX30基因后，小鼠肺組織中DSC3mRNA 的 表達顯著下調，表明SOX30對DSC3 的表達有著關鍵的調控作用，提示SOX30可能是一個新的橋粒基因轉錄調控因子。

由于DSC3受SOX30表達調控，因此有可能在SOX30抑癌中發揮重要作用。我們前期的研究[7]也表明，SOX30在肺腺癌中是一個典型的抑癌基因，其表達與肺腺癌患者預后正相關，而在肺鱗癌中無明顯的抑癌作用，因此，SOX30與DSC3的表達僅在肺腺癌中相關，與 SOX30基因的功能一致。為明確DSC3是否是SOX30基因在肺腺癌中發揮抑癌功能的可能下游分子，我們利用集落形成實驗和細胞劃痕愈合實驗檢測干擾 DSC3基因的表達后是否會影響SOX30對A549細胞的增殖和遷移抑制，結果顯示干擾 DSC3基因的表達顯著減弱SOX30對A549細胞的增殖和遷移抑制，表明DSC3是SOX30在肺腺癌中發揮抑癌功能的重要分子。但是，二者之間的這種調控作用，如何在腫瘤發生過程中影響橋粒的形態結構？是否二者進一步調控其他下游信號通路，都值得進一步研究。

綜上所述，本研究首次發現SOX30是橋?；駾SC3的轉錄調控因子，且DSC3是SOX30發揮抑癌功能的重要下游靶分子。本研究為進一步探索 SOX30基因功能以及SOX30-DSC3在肺腺癌發生發展中的作用和臨床意義提供了重要依據。

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