肉蓯蓉苯乙醇總苷抗肝癌作用的實驗研究

胡瓊，由淑萍，劉濤， *，汪波，劉昕，蔣遠東

（1．新疆醫科大學公共衛生學院，新疆烏魯木齊830011；2．新疆醫科大學護理學院，新疆烏魯木齊830011）

肉蓯蓉(cistanche)主產于新疆、內蒙古阿拉善盟，素有“沙漠人參”之美譽，具有極高的藥用價值，是中國傳統的名貴中藥材[1]。始載于《神農本草經》，被列為上品，其味甘、咸，性溫，具有補腎陽、益精血、潤腸通便的作用，常用于治療男子陽痿、女子不孕、腰膝冷痛、血枯便秘等癥[2]。國內學者對肉蓯蓉的化學成分進行了大量的研究，包括苯乙醇總苷(phenylethanol glycosides from cistanche，CPhGs)、環烯醚萜類、木脂素類、多糖、生物堿等，其中最主要的成分為CPhGs[3-4]，現代藥理研究表明CPhGs具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節、增強記憶、助陽等多種藥理活性，同時課題組成員前期對CPhGs進行的大量研究表明CPhGs具有抗肝纖維化的作用[5-7]。本實驗用肉蓯蓉藥材中分離得到的CPhGs，研究其對肝癌H22荷瘤小鼠的抗肝癌作用，旨在為CPhGs的抗肝癌作用機制及相關健康產品及藥品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 受試物及實驗動物

肉蓯蓉苯乙醇總苷(CPhGs)由新疆藥物研究所趙軍研究員提取分離并鑒定，純度為70%[8]，試驗時用0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5%CMC-Na)溶解，配制成不同濃度，4℃保存，1周內使用。

SPF級昆明種小鼠，雄性，60只，體質量18~22 g，購自新疆醫科大學實驗動物研究中心，合格證號為SCXK(新)2016-0002，使用許可證號 為 SYXK(新)2016-0003。

1.2 細胞株

小鼠H22肝癌細胞株，由武漢普諾賽生命科技有限公司提供，貨號CL-0341。

1.3 儀器及主要試劑

低速離心機(70L-5-A型，上海安亭)；CO2培養箱(Heal Force，HF240)；電熱恒溫水槽(DK-8D，上海一恒科技有限公司)；酶標儀(Bio-rad)；游標卡尺(上海將來實驗設備有限公司)；電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)。

肝復樂為康普藥業股份有限公司產品(國藥準字Z20060389)；RPMI-1640培養基和1%雙抗(以色列BI公司)；胎牛血清(Gibco，美國)；0.4%臺盼藍和4%多聚甲醛(北京索萊寶)；小鼠腫瘤壞死因子 α( TNF- α)、白介素2(IL-2)、甲胎蛋白(AFP)ELISA試劑盒(武漢華美)。

1.4 試驗方法

1.4.1 肝癌H22荷瘤小鼠模型的建立于37℃復蘇H22細胞，離心棄上清，加入新鮮RPMI-1640完全培養基重懸細胞快速復蘇，體外培養活細胞達95%以上，至細胞密度達1×106/mL時接種于小鼠腹腔，每只0.2mL。約8~l0d傳代一次。無菌抽取培養至8d左右的小鼠腹腔H22瘤液，生理鹽水稀釋調整瘤細胞數為l×107/mL，充分混勻，備用。除空白對照組在同部位注射等量生理鹽水外，其余各組小鼠經消毒后，于其前肢右側腋下接種H22瘤細胞懸液，每只0.2 mL[9-10]，造模24h后每天觀察瘤體生長情況。

1.4.2 分組及給藥隨機將上述造模的H22荷瘤小鼠分為5組，分別為模型組，陽性治療組(肝復樂1351.5 mg/kg)[11]，CPhGs高(500mg/kg)、中(250mg/kg)、低(125 mg/kg)劑量組，每組10只。于造模24h后開始灌胃給藥，除空白對照組和模型組給予同體積的0.5%CMCNa溶液外，其余各組分別按照給定劑量灌胃給予陽性藥物或CPhGs，連續10d[12-13]。期間每天觀察荷瘤小鼠精神活動狀態、右腋膨隆大小及出現時間、毛色及食欲等情況。末次給藥24h后，稱質量，摘眼球取血，分離血清備用；頸椎脫臼法處死小鼠，分離脾臟、肝臟，稱質量，計算肝脾系數；完整剝取瘤體，濾紙拭干凈后稱質量，計算各組小鼠的腫瘤抑制率；瘤體組織行病理組織學檢測。

1.4.3 檢測指標①脾臟和肝臟系數測定：各組小鼠處死后分別剪取脾臟和肝臟并稱質量，計算臟器系數，臟器系數=臟器質量/小鼠體質量×100%。②瘤質量及抑瘤率測定：末次給藥24h后，頸椎脫臼法處死小鼠并稱體質量，完整剝取瘤體，用濾紙擦拭干凈后置電子天平上稱瘤質量，根據瘤質量計算各給藥組小鼠的腫瘤抑制率，抑癌率=(模型組瘤質量-實驗組瘤質量)/模型組瘤質量×100%。③摘眼球取血后，分離血清-80℃保存待檢。按ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-2、TNF-α和AFP含量。④腫瘤組織病理學檢查：各組瘤體用4%多聚甲醛固定24h后，石蠟包埋切片，常規HE染色，在光鏡下觀察腫瘤組織病理學改變，以腫瘤細胞壞死的面積大小初步判定CPhGs藥物的治療效果。

1.5 統計學方法

應用SPSS17.0軟件進行統計分析，各組數據結果以表示，以單因素方差分析進行多組 間 數據比較，檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 小鼠的一般情況觀察

給藥前，各組間小鼠體質量差異均無統計學意義(P>0.05)。模型組在試驗過程中由于灌胃操作有2只小鼠死亡。給藥后，與空白對照組比較，模型組小鼠體質量隨腫瘤的生長而增加，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，陽性治療組和CPhGs各劑量組小鼠體質量均有一定的下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。試驗第4d開始，小鼠腋下開始出現膨隆，動物精神活動狀態變差，對外界刺激反應遲鈍，食欲減退，毛色變暗淡。模型組最先出現腫瘤塊，且生長速度最快，以上反應最明顯，CPhGs低、中劑量組次之，高劑量組和陽性治療組腫瘤生長較慢，生存質量較好，未見明顯的不良反應(見表1)。

表1 肉蓯蓉CPhGs對H22荷瘤小鼠體質量的影響(-x±s)

2.2 肉蓯蓉CPhGs對H22荷瘤小鼠脾臟和肝臟系數的影響

表2結果顯示，與空白對照組相比，模型組脾臟系數明顯減少、肝臟系數明顯增大(P均<0.01)；與模型組比較，陽性治療組、CPhGs各劑量組脾臟系數明顯增大、肝臟系數明顯降低(P均<0.01)，表明CPhGs可在一定程度上提高荷瘤小鼠的免疫功能，抑制肝臟受損。

表2 肉蓯蓉 C PhGs對 H 22荷瘤小鼠臟器系數的影響(-x± s)

2.3 肉蓯蓉CPhGs對H22荷瘤小鼠瘤體生長的影響

表3結果顯示，與模型組比較，陽性治療組與CPhGs中、高劑量組H22荷瘤小鼠瘤質量明顯下降，差異具有統計學意義(P均<0.01)，陽性治療組及CPhGs中、高劑量組腫瘤抑制率分別為56.91%、52.97%和35.80%。

2.4 肉蓯蓉CPhGs對H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α和AFP含量的影響

由表4可見，與空白對照組比較，模型組TNF-α和AFP含量顯著增加，差異均具有統計學意義(P均<0.05)；與模型組比較，陽性治療組與CPhGs中、高劑量組IL-2含量均明顯增加(P均<0.05)；陽性治療組和CPhGs各劑量組TNF-α含量均明顯減少(P<0.05)；陽性治療組與CPhGs中、高劑量組AFP含量均明顯下降(P<0.05)；CPhGs高劑量組IL-2含量、TNF-α含量及AFP含量與陽性治療組更接近，但差異無統計學意義(P>0.05)。提示肉蓯蓉CPhGs可促進IL-2的表達，抑制TNF-α與AFP的表達，且高劑量組效果更好。

表3 肉蓯蓉CPhGs對H22荷瘤小鼠瘤體生長的影響(-x±s)

表4 肉蓯蓉CPhGs對H22荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α和AFP含量的影響(-x±s)

2.5 腫瘤組織病理學觀察

大體可見：模型組瘤體較大，表面顏色淡紅，質地較軟，與周圍組織分界較清楚，剖面滲血較多。CPhGs各劑量組腫瘤組織邊緣區毛細血管明顯減少，腫瘤瘤體較小，表面灰白，質地較韌，剖面灰白，中央區可見壞死，切面滲血較少。

光鏡HE染色(圖1)可見：模型組荷瘤小鼠的癌組織中，有大量的腫瘤細胞，細胞排列緊密，細胞核著色均勻，形態清晰，細胞間質較少。與模型組相比較，給藥組腫瘤組織中細胞數明顯減少，形態不規則，異質性降低，細胞核破碎，并伴有大量細胞壞死，壞死周邊有大量的炎細胞浸潤(包括中性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞，如圖中箭頭所示)，且高劑量組CPhGs腫瘤細胞壞死區域出現肉芽組織的修復，其中CPhGs不同劑量組隨著給藥劑量的增加，腫瘤細胞的壞死面積也在增大，而CPhGs高劑量組與陽性治療組有相當量的腫瘤細胞壞死，因此，可以初步判斷CPhGs對H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的治療效果。

圖1 CPhGs對肝癌荷H22 瘤 小鼠的治療效果(H E染 色，× 2 00)

3 討論

原發性肝癌是一種臨床上常見的惡性腫瘤，占我國腫瘤發病率的第4位，死亡率的第2位[14]，其防治仍是我國目前研究的熱點問題。傳統中藥在控制患者病情發展、改善癥狀體征及提高生存質量等方面的優勢日漸顯現，為從我國中藥中尋找低毒、高效的抗肝癌作用的藥物，本課題采用H22肝癌細胞制備H22荷瘤小鼠腫瘤模型，將不同劑量的CPhGs處理組與模型對照組和肝復樂陽性治療組進行比較，探索CPhGs對H22荷瘤小鼠體內抗腫瘤的作用及其機制。

結果顯示，模型組最先出現腋下腫瘤膨隆且生長最快，小鼠精神狀態變差、食欲下降、毛色開始暗淡等反應，CPhGs低、中劑量組次之，高劑量組和肝復樂陽性治療組較慢，且CPhGs各劑量組小鼠體質量和肝復樂陽性治療組均無明顯的下降，提示CPhGs藥物可以相對改善H22荷瘤小鼠的生存質量、降低腫瘤對機體的毒性。CPhGs各劑量組、肝復樂陽性治療組瘤質量均明顯低于模型對照組，且高劑量組腫瘤抑制率與肝復樂陽性治療組相當，提示CPhGs對H22荷瘤小鼠體內腫瘤具有一定的抑制作用，另外，本研究結果顯示，肝復樂陽性治療組和CPhGs各劑量組的脾臟系數均高于模型組，而肝臟系數均低于模型對照組，提示CPhGs在發揮抑制腫瘤作用的同時在一定程度上提高了荷瘤小鼠的免疫功能且對肝臟也有保護作用，但對脾臟及肝臟的作用與肝復樂無明顯差異。

IL-2是免疫系統中的一類細胞生長因子，參與細胞免疫，在機體復雜免疫網絡中起中心調節作用，能夠通過促進T細胞增殖和分化等作用提高機體的免疫機能，并能產生具有抗腫瘤活性的免疫細胞。研究發現IL-2可促進淋巴因子激活的殺傷細胞的存活、擴增及活化，這種細胞是淋巴細胞與IL-2接觸后產生的一種具有高效抗腫瘤細胞的殺傷細胞，且這種殺傷細胞只識別腫瘤抗原，對宿主正常細胞無影響[15-16]。本實驗結果顯示，CPhGs高、中劑量組可顯著提高小鼠IL-2的含量，表明CPhGs可增強H22荷瘤小鼠的免疫能力，有利于機體殺傷腫瘤細胞。

TNF-α是迄今為止所發現的直接抗腫瘤作用最強的生物活性因子之一[17-18]。TNF通過與受體結合誘導腫瘤細胞凋亡、增強宿主免疫功能、作用腫瘤血管內皮細胞，導致血管功能紊亂，繼而引起腫瘤出血壞死等途徑來發揮抗腫瘤作用[19]，但TNF-α在腫瘤中表現出兩重性，既可致腫瘤壞死，也可促腫瘤的生長[20-21]。在正常機體內TNF-α的濃度較低，具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞血管形成血栓而發生出血壞死、增強機體抗腫瘤免疫功能等作用；同時TNF作為一個內源性的腫瘤促進因素，由腫瘤細胞本身產生的TNF-α可以刺激腫瘤細胞生長，并抑制免疫效應細胞對腫瘤細胞的毒性作用；因此，TNF-α的生物學作用與其體內的水平高低密切相關。本實驗中發現，與正常組比較，模型組TNF-α明顯升高，這與腫瘤的TNF-α升高一致，CPhGs各劑量組小鼠TNF-α水平顯著下降，表明CPhGs具有抑制H22荷瘤小鼠血清中TNF-α異常升高的作用，抑制腫瘤的發生。

正常情況下，AFP主要來自胚胎的肝細胞，胎兒出生后約兩周AFP從血液中消失，因此正常成年人血清中AFP的含量尚不到20μg/mL[22]。在成人，AFP可以在大約80%肝癌患者血清中升高[23]。當人肝細胞發生癌變時，其恢復產生AFP這種蛋白的功能，而且隨著病情惡化它在血清中的含量也會急劇增加。AFP作為診斷原發性肝癌的一個特異型臨床指標，血清AFP濃度通常與肝癌大小呈正相關[24]。本實驗結果顯示CPhGs高、中劑量組可顯著降低小鼠AFP的含量，表明CPhGs能夠抑制H22荷瘤小鼠血清中AFP的表達，抑制腫瘤的生長。

HE染色可見，與模型組比較，CPhGs能明顯促進腫瘤細胞凋亡，使腫瘤細胞生長受抑制，瘤細胞異質性降低，并伴有大量細胞壞死，其中CPhGs不同劑量組隨著給藥劑量的增加，腫瘤細胞的壞死面積也在增大，而CPhGs高劑量組與肝復樂陽性治療組有相當量的腫瘤細胞壞死，提示CPhGs對H22肝癌荷瘤小鼠具有良好的抑瘤效果。

綜上，CPhGs具有良好的抗肝癌作用，可能與CPhGs降低荷瘤小鼠血清中AFP含量及提高荷瘤小鼠免疫能力有關。本研究為利用肉蓯蓉中CPhGs成分開發新的抗肝癌藥物提供了基礎數據。

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