紅景天提取物對順鉑致腎細胞毒性的保護作用

韓何丹，王海，李艾琳，韓照玉，高麗萍*

（北京聯合大學健康與環境學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京100191）

順鉑[cis-dichlorodiamineplatinum(II)，DDP]是以二價鉑為中心與2個氯原子和2個氨基結合而成的一類鉑類藥物[1]，是臨床最常用的抗腫瘤藥物之一[2]。DDP在臨床治療過程中常伴有一定毒副作用[3-4]，如腎毒性、耳毒性、神經毒性、生殖毒性、心臟毒性和致吐性等，且隨著DDP使用劑量的增加其引起的毒副作用也會越來越明顯[5]。其中腎毒性是臨床DDP使用量受限制的主要原因[6-7]。因此，在臨床治療中減輕DDP的腎毒性顯得尤為重要。

有學者提出，在使用DDP的同時加入輔助保護劑以降低DDP引起的腎毒性[2]。眾多研究表明，許多中藥單體化合物對防治DDP引起的腎毒性有很好的緩解作用。如姜黃素[8]能激活抗氧化反應體系防止細胞凋亡，還能改善線粒體脂質過氧化反應、清除線粒體內自由基，從而降低DDP引起的細胞氧化損傷。五味子乙素[9]能夠增強細胞抗氧化能力，改善線粒體膜的通透性以降低DDP引起的細胞損傷。低聚葡萄籽原花青素[10]和蕓香苷[11]都能降低DDP誘導細胞產生的活性氧族(reaction oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)。

現代醫學研究指出，紅景天提取物(Rhodiola extract，RE)具有抗癌、抗缺氧、抗病毒、抗輻射、抗疲勞、對中樞神經的雙向調節、延緩衰老等廣泛的生理活性[12-13]。據報道，紅景天提取物可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，可降低脂質過氧化物(lipid peroxide，LPO)的含量，在微粒體模型中具有較好的抗氧化活性[14-15]。有研究表明紅景天苷類似物對缺氧所致的血管內皮細胞損傷具有顯著的保護作用[16]。然而，紅景天提取物對抗DDP誘導人胚腎細胞氧化損傷的影響尚未見報道。本課題通過研究RE對DDP所致HEK293細胞毒性的保護作用，探討RE拮抗DDP所致腎細胞氧化損傷作用的機制，以期為臨床化療過程中減輕DDP細胞毒性提供理論基礎及實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胚腎細胞(HEK293)來自中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院細胞中心；DDP注射用粉劑購自齊魯制藥公司(無菌生理鹽水溶解)；紅景天提取物購自上海諾德生物實業有限公司，含3%紅景天苷，用前需用二甲基亞砜(DMSO)適當稀釋，過濾除菌后避光保存；胎牛血清購自美國Hyclone公司；DMEM/H培養基、0.25%胰酶、雙抗(100μg/mL鏈霉素，100U/mL青霉素)均購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；CCK-8毒性檢測試劑盒購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；其他試劑均為市售分析純。

1.2 細胞培養

HEK293細胞常規培養于含有15%新生胎牛血清和雙抗的DMEM高糖培養基中，培養箱環境為37℃、CO2體積分數5%、飽和濕度。待細胞匯合度至80%~90%時，用胰酶消化，按1∶3進行傳代，每隔1天換1次培養基，每2~3d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

1.3.1 DDP對HEK293細胞的毒性作用將100μL(濃度為1×105/mL)的HEK293細胞接種到96孔板中，待細胞生長到匯合狀態，加入終濃度分別為0、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128mg/L的DDP，每組設6個復孔，培養箱孵育24h，然后每孔加入100μL含10%CCK-8的培養基，繼續孵育4h，450nm處檢測吸光度D(450)值，按下式計算細胞存活率。

細胞存活率=D( 4 50 )實驗組/D(450)對照組×100%

并計算DDP對HEK293細胞的半數抑制濃度(I C50)，由此確定DDP誘導HEK293細胞損傷模型的最佳使用濃度。

1.3.2 紅景天提取物作用后HEK293細胞的存活率處理和計算方法同上，紅景天提取物終濃度依次為：0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64mg/L。

1.3.3 聯合作用后對HEK293細胞毒性作用的影響將100μL(濃度為1×105個/mL)處于對數生長期的細胞接種到96孔板中，待細胞生長至匯合狀態時，加藥處理。試驗分4組：即正常對照組(正常細胞，不做其他處 理 )、 DDP組 (加 入 20mg/L DDP)、 紅 景 天 提 取 物+DDP[在加DDP前2h分別加入不同濃度(2、4、6、8、10、12、14、16mg/L)紅景天提取物孵育細胞]、陰性對照組(在加藥時加入等體積PBS)。每組設6個復孔，在37℃、CO2體積分數為5%的孵育培養箱中培養24h后按1.3.1所述檢測細胞存活率。

1.4 HEK293細胞蛋白濃度測定及細胞內GSH、SOD、MDA的測定

細胞分為4組即正常對照組(正常細胞，不做其他處理)、紅景天提取物保護組(加入12mg/L紅景天提取物)、DDP模型組(加入20mg/L DDP)、紅景天提取物和DDP聯合處理組(加入12mg/L紅景天提取物和20mg/L DDP)。將2mL(濃度為1×105個/mL)處于對數生長期的細胞接種到6孔板中，待細胞生長至融合狀態時，按照實驗分組加藥處理。繼續培養24h后除去培養液，PBS洗1遍，每孔加入300μL PBS，用細胞刮收集細胞后，將裝有細胞懸液的離心管放在冰水浴中，用細胞破碎儀破碎1min；然后12000r/min離心10min，收集上清液，按照試劑盒說明書進行細胞蛋白濃度和MDA、GSH含量以及SOD活力測定。

1.5 統計學方法

使用SPSS22.0進行數據統計分析，結果以x±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，以 α=0.01為檢驗水準。用Origin9.1軟件作圖。

2 結果

2.1 DDP對HEK293細胞的毒性作用

見圖1。不同濃度DDP作用于HEK293細胞24h后，對細胞生長有不同程度的抑制作用。隨著DDP濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，與對照組比較，1~128mg/L DDP處理組細胞存活率均顯著降低(P均<0.01)，且呈現劑量-效應關系(r=0.85， P=0.002)。經統計分析得出，DDP對HEK293的IC50為19.78mg/L，其中，20mg/L是與IC50最為接近的整數濃度，為提高后續試驗的效率，選擇將其作為后續建立DDP損傷模型的濃度。

圖1 不同濃度DDP 對 H EK293 細 胞生長存活率的影響(n=6)

2.2 紅景天提取物對HEK293細胞存活率的影響

見圖2。不同濃度的紅景天提取物作用于HEK293細胞24h后，對細胞存活率有不同程度的影響。在0.5~16mg/L范圍內細胞存活率隨紅景天提取物濃度的增加逐漸升高，且與正常對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)。紅景天提取物濃度為16mg/L時，細胞存活率最高，當濃度大于16mg/L時，細胞存活率逐漸下降，當紅景天提取物濃度為64mg/L時，可顯著抑制HEK293細胞的生長，與正常對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。由此說明，紅景天提取物對HEK293細胞的影響具有“低濃度促進，高濃度抑制”的特點。

圖2 不同濃度 R E對 HEK293細胞存活率的影響(n =6)

2.3 紅景天提取物對DDP所致HEK293細胞毒性的影響

見圖3。用終濃度為20mg/L的DDP作用HEK293細胞24h建立細胞損傷模型。和DDP組相比，6~16 mg/L紅景天提取物預處理后，細胞存活率均明顯升高(P<0.01)，當紅景天提取物濃度為12mg/L，細胞存活率最高，當濃度高于12mg/L，紅景天提取物的減毒作用逐漸減小，提示在一定濃度范圍內紅景天提取物對DDP誘發的HEK293細胞毒性有顯著的保護作用。

圖3 不同濃度 R E對 D DP 的 H EK293 細 胞毒性的影響(n=6)

2.4 紅景天提取物對DDP作用后的HEK293細胞內GSH、MDA含量和SOD活力的影響

見表1。與對照組相比，DDP作用下的HEK293細胞中GSH含量和SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；而RE作用 細 胞后，GSH、SOD和MDA水平均無顯著變化(P均>0.05)。經RE干預后，DDP處理24h(即RE+DDP組)，細胞GSH含量較DDP組顯著升高(P<0.01)，SOD活力也有與GSH類似的變化。DDP造成細胞內MDA含量明顯高于對照組，而RE+DDP組細胞內MDA含量較對照組顯著升高 (P<0.01)，但較DDP組卻顯著降低(P<0.01)。結果表明，RE對DDP造成的細胞氧化損傷有一定的保護作用。

表1 RE對順鉑作用后的HEK293細胞抗氧化指標的影響(n=3)

3 討論

DDP作為一種廣譜抗癌藥物，是當前臨床醫學上最常用和最有效的抗癌藥物之一[17-18]，但同時引起的嚴重不良反應限制了其用藥劑量和化療應用進程。DDP進入機體后主要經腎臟排泄，因此其腎毒性最為明顯[4]。大量研究結果表明，DDP對體外培養的正常細胞具有毒性作用。Lieberthal等[19]研究證實順鉑引起原代培養的腎小管上皮細胞死亡(包括凋亡和壞死)，死亡的形式取決于順鉑的濃度。閆長會[20]通過對人腎小管上皮細胞(HK-2)進行體外腎毒性研究發現 ， DDP 對HK-2細胞具有明顯的毒性作用。在本實驗中，DDP 明顯降低了HEK293細胞存活率，且呈現劑量依賴性。因此，減輕DDP腎毒性改善患者生活質量很有必要。

紅景天提取物(RE)作為一種天然活性物質，含有多種生物活性成分，主要為黃酮類物質和苯烷基苷類化合物，可消除機體內脂質過氧化所產生的自由基，是一種很好的自由基清除劑[21]，具有較強的抗氧化作用[22]。此外，RE可增強中樞膽堿能系統的功能活動，促進細胞代謝，增強細胞活力，從而阻抑細胞退化、變性和凋亡。文鏡等[23]通過體外實驗研究發現 R E可清除體內超氧自由基(O2-.)和羥自由基(·OH)。我們前期研究顯示 R E能有效抑制DDP誘導小鼠睪丸支持細胞TM4的細胞損傷[24]。在本實驗中，一定濃度范圍(0.5~16mg/L)內RE明顯提高了HEK293細胞 的 存活率，一定終濃度RE與DDP共同孵育可提高HEK293細胞存活率，表明RE對DDP所致HEK293細胞生長具有保護作用。

氧化應激是DDP腎毒性的主要原因。GSH是細胞防御有毒化合物或氧化應激化學反應最重要的分子之一。SOD是一種金屬蛋白，能夠清除機體內產生的氧自由基，從而保護細胞免受超氧化物自由基的損傷，與GSH有相似的功能。因此，檢測SOD和GSH含量可以反映細胞的抗氧化能力。有研究表明DDP可通過結合GSH而引起機體內GSH含量的嚴重損失，同時還能抑制谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)、SOD等的活性，從而降低機體的抗氧化能力[25]。Shah等[26]將體外血漿和細胞組分中的GSH進行不同濃度DDP處理，結果發現GSH濃度呈明顯下降趨勢。可推斷，DDP治療很可能引起血液中GSH水平降低，進而導致機體的抗氧化能力下降。Naziroglu等[27]研究表明DDP對腎臟中SOD、GSH-Px和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶系統具有抑制作用。本研究結果表明，DDP組GSH和SOD的含量明顯低于對照組，DDP誘發產生的自由基明顯超出了HEK293細胞的自身清除能力，最終引起機體腎臟的氧化損傷。MDA是脂質過氧化反應的一種重要代謝產物，MDA的含量可以直接反映細胞內脂質過氧化程度，從而間接反映了細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究結果表明，DDP組MDA的含量遠高于對照組，提示細胞內的GSH被DDP耗竭，降低了機體清除自由基的能力，從而引發氧化應激反應。該結果與許晗等[28]的研究結果一致。經12mg/L的RE干預后，相對于DDP模型組，HEK293細胞存活率、細胞SOD活力和GSH含量明顯提高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01)，提示紅景天提取物能夠清除超氧化物陰離子等自由基，減少脂質過氧化反應，減輕DDP引起的氧化應激，從而拮抗DDP腎毒性。

綜上，紅景天提取物能在一定濃度范圍內提高細胞存活率，可拮抗順鉑導致的HEK293細胞氧化損傷，提示紅景天提取物對順鉑致腎細胞毒性具有明顯的保護作用。

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