紡錘體檢查點功能復合物基因MAD1L1遺傳變異與潮汕地區女性乳腺癌易感性研究

楊少宜，張慶英，*，吳俊東，林秋強，王銳鋒，鄭慶元，蔡奮

（1．汕頭大學醫學院公共衛生與預防醫學教研室，廣東汕頭515041；2．汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院，廣東汕頭515041；3．汕頭市澄海區人民醫院，廣東汕頭515899；4．汕頭市金平區婦幼保健院，廣東汕頭515041）

乳腺癌是嚴重威脅世界女性健康的常見惡性腫瘤，全球范圍內，每年有超過100萬人被確診患乳腺癌，至少40萬人死于該疾病，占全部腫瘤死因的14%，位居女性死因榜首[1]。近30年來中國乳腺癌的發病率增長了20%~30%，并以每年3%~5%的速度增長且呈現出年輕化的趨勢[2-3]，已成為突出的公共衛生問題。因此，探究與乳腺癌發病相關的環境及遺傳因素及其作用機制對于乳腺癌的防治有著重要意義。

染色體非整倍性是人類實體腫瘤最為普遍的特征，被證實與腫瘤的發生、發展密切相關[4-5]。有絲分裂阻滯缺陷1類似物1(mitotic arrest deficient1-like1，MAD1L1)作為紡錘體組裝檢驗點(the spindle-assembly checkpoint，SAC)的重要組成成員，在細胞周期調控中通過與有絲分裂阻滯缺陷2類似物1(MAD2L1)結合形成四聚體復合物共同在啟動檢驗點信號中發揮作用，MAD1L1結構上的異常均可能導致SAC功能失活，進而導致染色體非整倍性或癌變[6-9]。在前期的研究中，研究者發現定位于染色體7p22.3區域內存在著一個MAD1L1基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點，即rs1801368，該位點上堿基的突變會導致所編碼的氨基酸由精氨酸轉變為組氨酸，進而削弱其在執行有絲分裂阻滯功能上的作用，可能導致染色體不穩定的發生[8-9]。相關研究報道亦證實該位點的突變與肺癌及結直腸癌患病風險相關[6，10]，但目前關于該位點的變異與乳腺癌的關系尚未見報道。據此，本研究通過分析潮汕地區女性乳腺癌患者及對照人群中的M AD1L1rs1801368位點的基因變異情況，結合生理指標、臨床指標、疾病史、生活方式等指標，揭示環境與M AD1L1rs1801368遺傳變異與乳腺癌發生風險的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用病例-對照研究，入選2015年12月—2017年12月就診于汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院初診為乳腺癌、未經化療和放療的住院患者作為病例，選取同期居住在潮汕地區的健康居民作為對照。所有患者的確診均以組織病理學檢查結果為依據，同時排除患兩種或兩種以上惡性腫瘤、既往有腫瘤史及乳腺癌非原發腫瘤患者。健康對照的納入標準為：與乳腺癌患者無親緣關系；無腫瘤史或乳腺疾病史；經乳腺彩超、乳腺X線檢查無任何患乳腺癌或可疑乳腺癌前損傷或患其他腫瘤跡象。本研究共納入病例191例，健康對照225例，經研究對象知情同意，并獲得汕頭大學醫學院倫理委員會通過。

1.2 調查方法

乳腺癌病例的調查采用病歷回顧的方式獲得人口統計學特征信息(包括年齡、住址、職業、民族、受教育程度、醫保類型)，女性生理生育指標(初潮年齡、絕經與否、絕經年齡、月經周期、生育狀況、哺乳情況等)，生活方式(吸煙、飲酒狀況)，人體測量指標(身高、體質量、血壓、心率、心電圖)，生化指標(總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖)，臨床病理 指 標[腫瘤病理類型、腫瘤體積、臨床TNM分期、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕酮受體(progesteronereceptor，PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2)、細胞增殖核抗原Ki-67(nuclcar-associated antigen Ki-67，Ki-67)狀態、分子分型和組織學分級]及疾病史(糖尿病史、高血壓病史、血脂代謝紊亂病史、乳腺癌家族史、癌癥家族史、良性乳腺疾病史)。

健康對照的調查采用現場問卷調查、體格檢查、生化檢查的方式，對自愿接受調查者簽署知情同意書，強調隱私保護。調查問卷的內容涵蓋上述人口統計學特征、女性生理生育指標、疾病史。現場獲得人體測量參數并采集非抗凝血樣2 m L，其中1 m L通過生化檢測儀獲得對照生化指標，另1 m L用于后續基因分型。

1.3 DNA提取

采用DNA提取試劑盒提取病例及對照樣本全基因組 DNA (QIAamp DNA BloodMini Kit， 貨 號 51106)，DNA的濃度、純度經NanoDrop2000微量紫外分光光度計測定。提得的DNA樣本置于-20℃冰箱保存備用。

1.4 基因分型

將DNA樣本統一配制為40ng/μL的濃度，通過鼓風干燥箱對樣本進行烤干。采用國際主流SNP分型TaqMan熒光雙標記探針法對入選位點進行基因分型，實驗中所需PCR引物和TaqMan探針由ABI公司設計合成。PCR反應體系為(總體積5μL)：TaqManTMUniversalMasterMix2.5μL，40×探針0.125μL，超純水2.375 μL。應用ABI QS12K高通量熒光定量PCR系統對樣本進行基因分型，擴增條件如下：50℃預變性2min→95 ℃變性15s→60 ℃ 退火1min→60℃延伸90s，50個循環。通過隨機抽取5%的樣本進行二次分型，以對分型結果進行重復性檢驗，兩次結果一致率控制在95%以上。

1.5 統計學分析

采用SPSS21.0進行統計分析。計量資料以-x±s表示，計數資料以例數及百分比表示。對于服從方差齊性、正態性的計量資料采用t檢驗，不服從正態性的計量資料或等級資料采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗。率或構成比的比較采用 χ2檢驗，病例與對照的基因型頻率分布比較采用 χ2檢驗或精確檢驗法進行統計分析，運用二分類非條件Logistic回歸分析不同基因型與乳腺癌發病風險間的關系。

2 結果

2.1 病例組與對照組的一般特征比較

病例組與對照組在年齡、身高、體質量上的差異均無統計學意義(P>0.05)，但在職業與受教育程度上的差異均有統計學意義(P<0.05)。生化指標方面，病例組的平均心率、收縮壓、舒張壓、空腹血糖值均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；病例組的總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白均值均低于對照組，兩組在高密度脂蛋白指標上差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 乳腺癌患者與健康對照一般特征比較(-)x±s

2.2 病例組與對照組女性相關危險因素比較

乳腺癌患者與健康對照在初次生育年齡、哺乳方式、絕經狀態上的差異均無統計學意義(P>0.05)，兩組在初潮年齡、孕數、生育胎數、最長哺乳時間及流產胎數方面差異均具有統計學意義(P均<0.05)。相關疾病史方面，病例組中14例有乳腺癌家族史(7.4%)，35例有癌癥家族史(18.4%)；對照組中均無乳腺癌家族史，3例有癌癥家族史(1.3%)，二組間差異有統計學意義(P均<0.001)。在子宮切除術史和子宮卵巢疾病史上，差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者與健康對照女性相關危險因素比較(-)x±s

2.3 rs1801368基因型頻率分布及與乳腺癌發病風險的關系

MAD1L1基因多態性位點rs1801368在病例組中的基因型分布頻率分別為CC39例(20.63%)，CT81例(42.86%)，TT69例(36.51%)；在對照組中的基因型分布頻率分別為CC63例(30.14%)，CT86例(41.15%)，TT60例(28.71%)，兩組間差異無統計學意義(P=0.066)。但經調整年齡、初潮年齡、絕經狀態、受教育程度、職業類型等混雜因素后的多因素分析結果表明，以野生純合子基因型CC為參照，攜帶突變型TT基因型的女性患乳腺癌的風險是野生型的3.40倍(O R=3.40，95%C I：1.29~8.97，P =0.013)，見表3。

2.4 rs1801368基因型分布與乳腺癌患者病理特征間的關系

結果顯示M AD1L1多態性位點rs1801368不同基因型在乳腺癌患者腫瘤病理類型、腫瘤最大直徑、區域淋巴結臨床分類、腫瘤遠處轉移情況、腫瘤臨床分期、ER、PR、Herb-2、Ki-67受體情況、腫瘤分子分型、腫瘤組織學分級及危險度評價等臨床病理參數上差異均無統計學意義(P均>0.05)，結果見表4。

表3 MAD1L1多態性位點rs1801368基因型頻率分布及與乳腺癌發病風險的關系

表4 MAD1L1多態性位點rs1801368基因型與乳腺癌患者臨床病理特征分析

3 討論

紡錘體組裝檢驗點作為染色體正確分離的監督機制，在染色體沒有完成正確排列之前，能夠通過抑制有絲分裂后期的開始進而確保遺傳物質的正確分配[11]。MAD1L1作為紡錘體檢查點功能復合物的重要組成成員，通過與MAD2L1結合共同在啟動檢驗點信號中發揮作用并對其行使轉運和激活功能，MAD1L1結構上的異常均可導致紡錘體組裝檢驗點功能失活，進而導致染色體出現非整倍性或癌變[8-11]。此前，Yuan等[12]通過分析包括M AD1L1在內的8個SAC基因在12種乳腺癌細胞株中的RNA和蛋白表達水平發現大多數乳腺癌細胞存在染色體不穩定和紡錘體檢查點功能缺陷現象；Qian等[13]的研究則發現相比正常乳腺細胞，MAD1L1蛋白表達水平在癌細胞核中顯著上調，并與Herb-2狀態、腫瘤類型及P53表達有關；Pujana等[14]進行的一項有關乳腺癌易感性與中心體功能障礙的網絡建模研究發現MAD1L1存在于以BRCA為中心的網絡模型中，并識別到MAD1L1-BRCA1的內源性蛋白復合物。上述研究結果均為本研究的假設即M AD1L1基因上某些位點的突變與女性乳腺癌易感性相關奠定了基礎。

本研究通過研究潮汕地區女性乳腺癌患者及對照人群中M AD1L1rs1801368位點的基因變異情況，結合生理指標、臨床參數、疾病史、生活方式等指標，最終結果表明，M AD1L1多態性位點rs1801368堿基的突變與女性患乳腺癌風險有關，攜帶突變型基因型的女性是攜帶野生型基因型女性患病風險的3.40倍，提示MAD1L1上rs1801368堿基的突變可能可以作為女性乳腺癌患病風險篩查的分子標志物。本研究結果與此前該位點在肺癌及結直腸癌的中國漢族湖北武漢人群中的研究結果一致，此前Guo等[10]通過對中國漢族湖北武漢地區的肺癌及健康對照M AD1L1多態性位點rs1801368進行基因分型，最終發現該位點攜帶突變型基因型的人群患肺癌的風險是攜帶野生型基因型的1.40倍，相似的結論亦在同一地域的由結直腸癌患者和健康對照組成的病例對照研究中得到驗證[6，10]。

通過收集病例對照的人口學特征、疾病史、人體測量指標及生化指標等信息進行比較，結果發現乳腺癌患者相比于健康對照在空腹血糖、收縮壓、舒張壓、心率4項指標上數值均較高；而總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均較低，提示乳腺癌的發病還與人體代謝疾病相關，是一種多因素相互作用的復雜疾病。流行病學資料以及臨床研究已證實代謝綜合征與乳腺癌的發生發展和預后密切相關，其影響機制可能涉及胰島素、胰島素抵抗、內源性激素、瘦素、脂聯素、炎癥因子等多種因子[15-18]。

本研究挑選的位點位于外顯子區域，據報道其堿基的突變會引起編碼的氨基酸的改變進而影響紡錘體組裝檢驗點的功能，但尚未見有關該位點在乳腺癌人群中的報道，本次研究首次揭示了M AD1L1rs1801368基因變異與中國漢族潮汕地區女性乳腺癌易感性之間的關系。同時，相比于其他研究，本研究除收集病例對照常規的人口統計學特征、生理生育指標外，還收集了疾病史、臨床病理指標、生化指標等相關信息，資料較為全面，能更好地反映環境、遺傳變異與乳腺癌易感性之間的關聯。但另一方面，本研究亦存在一些局限性，例如前期收集得到的健康對照與乳腺癌病例在職業類型、受教育程度上存在差異導致與這兩個因素相關的變量之間亦存在差異，但在分析過程中通過校正排除了這些混雜因素的影響，結果仍能真實反映rs1801368基因型與乳腺癌患病風險之間的關系。另外，由于本研究目前樣本量偏少，加之腫瘤臨床病理特征分組較多，導致如腫瘤最大直徑大于5cm組及腫瘤分子分型為三陰性等部分組別樣本例數較少，統計檢驗效率較低，后續將擴大樣本量，提高檢驗效率。

綜上所述，紡錘體檢驗點基因M AD1L1多態性位點rs1801368堿基突變與女性乳腺癌發病風險相關，攜帶突變型純合子基因型的女性是乳腺癌的易感人群。通過對社區人群進行該風險位點的篩檢進而尋找易感人群，有針對性的加強女性對乳腺相關疾病知識的了解，同時女性在平時生活中應保持良好的生活習慣，定期對血糖、血壓、血脂進行監測，從而預防乳腺癌的發生。

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