普洱茶安全性毒理學評價研究概述

馬燕，陳立佼，呂才有，趙明

云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南 昆明 650201

食品安全性毒理學評價是保障食品安全和國民健康的重要手段，也是評價某種食品安全性的重要指標。我國已針對不同食品制定了安全性毒理學的評價標準和技術規(guī)范，發(fā)展了相應的新方法和新技術，使得我國食品安全性毒理學評價整體水平從檢驗設備、人員素質(zhì)，到檢驗的技術水平等均有顯著的提高，并逐漸與國際接軌，在保障食品安全方面發(fā)揮了重要作用[1]。

我國現(xiàn)行的食品安全性毒理學評價程序和方法標準是由國家衛(wèi)生和計劃生育委員會制定并于2015年5月1日起實施的，一共包括26項[2]，如《食品安全性毒理學評價程序》（GB 15193.1—2014）、《食品毒理學實驗室操作規(guī)范》（GB 15193.2—2014）、《急性經(jīng)口毒性試驗》（GB 15193.3—2014）、《細菌回復突變試驗》（GB 15193.4—2014）、《90天經(jīng)口毒性試驗》（GB 15193.13—2015）。標準規(guī)定了食品安全性毒理學評價程序，適用于評價食品生產(chǎn)、加工、倉儲（或貯藏）、運輸和銷售過程所涉及的可能對健康造成危害的化學、生物和物理因素的安全性，檢驗對象包括食品及其原料、食品添加劑、新食品原料、輻照食品、食品相關產(chǎn)品（用于食品的包裝材料、容器、洗滌劑、消毒劑和用于食品生產(chǎn)經(jīng)營的工具、設備）以及食品污染物[3]。食品毒理學安全性評價試驗內(nèi)容包括急性經(jīng)口毒性試驗、遺傳毒性試驗、28 d經(jīng)口毒性試驗、90 d經(jīng)口毒性試驗、致畸試驗、生殖毒性試驗和生殖發(fā)育毒性試驗、毒物動力學試驗、慢性毒性試驗、致癌試驗、慢性毒性與致癌合并試驗等[3]。

普洱茶加工的關鍵工序是一個多種微生物作用的自然發(fā)酵過程，微生物的發(fā)酵豐富了產(chǎn)品的內(nèi)含成分與風味[4]，也增加了一定的安全風險[5]。因此對普洱茶進行有效的安全性毒理學評價十分必要。基于此，自2003年起，西南大學的劉勤晉教授已開始了普洱茶毒理學研究[6]。筆者查閱中國知網(wǎng)、Pubmed，ACS Publications，ScienceDirect-Elsevier，Wiley 和Springer Link等國內(nèi)外科技文獻數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)9篇中文、6篇英文論文和碩士、博士論文各1篇，以普洱茶或含普洱茶的食品為材料，開展了毒理學評價研究。

1 急性經(jīng)口毒性實驗

急性經(jīng)口毒性試驗（GB 15193.3—2014）是指1次或24 h內(nèi)多次經(jīng)口給予實驗動物受試物后，動物短期內(nèi)（一般觀察7 d或14 d）出現(xiàn)的毒性效應。根據(jù)急性毒性的半數(shù)致死劑量（LD50），即能夠引起動物死亡率為50%的受試物劑量，毒物分成5級（表1）[7]。

表1 急性毒性（LD50）劑量分級表Table 1 The classification of dose (LD50) in acute oral toxicity tests

劉勤晉等[6]、陳文品等[8-9]、龔加順等[10]、陳娜等[11]、胡雪婷[12]、馬偉光等[13]、Wang等[14]、梁名志等[15]和吳婧等[16]學者以大、小鼠為模型，研究市售普洱茶、普洱茶特征成分、配方普洱茶、人工接菌發(fā)酵普洱茶、抗氧化制劑（含普洱茶）的急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn) LD50大于5 000 mg·kg-1，屬于實際無毒級別。另外，F(xiàn)ujita等[17]研究顯示，一次性攝入 2 000 mg·kg-1體質(zhì)量的普洱茶提取物，小鼠無異常和死亡（表2）。

2 28 d或90 d經(jīng)口毒性試驗

28 d 經(jīng)口毒性試驗（GB 15193.22—2014），即通過實驗動物連續(xù) 28 d經(jīng)口接觸受試物后引起的健康損害效應，用于評價受試物的短期毒性作用[18]。胡雪婷[12]開展28 d亞急性毒性試驗，發(fā)現(xiàn)普洱生茶高劑量組和熟茶高劑量組肝臟組織切片出現(xiàn)輕微病理學改變，大鼠的進食量、體質(zhì)量、臨床癥狀、血液學指標、器官病理學觀察、腎臟組織病理學檢查無不良反應，初步認為普洱生茶與熟茶未觀察到有害作用劑量分別為 2 500、5 000 mg·kg-1·d-1。Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn) 2 500、5 000 mg·kg-1·d-1的普洱生茶提取物觀測到了輕微毒性，而 5 000 mg·kg-1·d-1的普洱熟茶提取物未觀察到任何不良反應，認為攝入 1 250 mg·kg-1·d-1劑量的普洱生茶和 5 000 mg·kg-1·d-1的普洱熟茶提取物是安全的。

表2 普洱茶動物急性毒性實驗研究概述Table 2 Summary of the acute animal oral toxicity tests of Pu-erh tea

90 d經(jīng)口毒性試驗（GB 15193.13—2015）通過實驗動物在不超過其壽命期限10%的時間內(nèi)（大鼠通常90 d），重復經(jīng)口接觸受試物后引起的健康損害效應，以評價受試物的亞慢性毒性[20]。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù) 90 d攝入不同劑量（1 250、2 500、5 000 mg·kg-1·d-1）的普洱茶提取物，大鼠無死亡，體質(zhì)量、攝食率、器官重量無改變，無肉眼、臨床和組織病理學的改變，表明每天5 000 mg·kg-1劑量的普洱熟茶提取物無明顯不良效應。李艷艷等[21]以普洱熟茶（510、1 710 和 5 120 mg·kg-1·d-1）和普洱生茶（550、1 820、5 460 mg·kg-1·d-1）劑量灌胃90 d，各組各項血常規(guī)指標與對照組相比無顯著差異（P>0.05），除甘油三酯值顯著降低（P<0.05）外，其他各項生化指標均在正常值范圍內(nèi)，表明適宜濃度的普洱茶對 SD大鼠血液生理生化指標無不良影響（表3）。

3 遺傳毒性研究

遺傳毒性試驗是指對化學物質(zhì)改變細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的能力進行測試，確定其致突變性及對生物的影響，對可遺傳損傷、致癌性以及其他有關損傷進行評價的方法。陳文品等[8,22]、龔加順等[10]和吳婧等[17]開展了鼠傷寒沙門氏菌回復突變實驗（Ames試驗）、小白鼠骨髓微核試驗、中國倉鼠細胞（CHL）染色體畸變試驗、畸形精子檢測試驗，研究發(fā)現(xiàn)對原核細胞、真核細胞和生殖細胞都沒有致突變性。Wu等[23]發(fā)現(xiàn)普洱茶提取物不僅無細胞和遺傳毒性，還具有抗突變作用（表4）。

表3 普洱茶28 d或90 d經(jīng)口毒性試驗研究概述Table 3 Summary of the 28 d or 90 d oral toxicity tests of Pu-erh tea

表4 普洱茶遺傳毒性研究概述Table 4 Summary of the genetic toxicity evaluations of Pu-erh tea

4 其他毒性研究

Wang等[24]應用SD大鼠研究普洱茶的生殖毒性和發(fā)育毒性，發(fā)現(xiàn) 2 500 mg·kg-1·d-1的普洱茶提取物能減少F0親本和F1后代的體質(zhì)量增加，改變睪丸、前列腺和卵巢等器官的相對重量，引起胚胎-胎兒期的胚胎發(fā)育障礙，結(jié)果認為普洱茶的生殖毒性和發(fā)育毒性無效應劑量水平是 700 mg·kg-1·d-1。李紅霞等[25]發(fā)現(xiàn)普洱熟茶對小鼠肝細胞的毒性極小或無。王迪[26]研究發(fā)現(xiàn)各劑量的普洱茶提取物，均能夠降低喹烯酮所致的DNA損傷，而本身對肝細胞DNA沒有損傷作用。

5 臨床毒性或不良反應研究

Hwang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，健康志愿者（16位男性）每天攝入1 000 mL普洱茶提取物（約20 g原茶），連續(xù)7 d，體質(zhì)量無變化，無副作用，血液總膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、LDL-膽固醇、HDL-膽固醇無顯著變化。Fujita等[17]以志愿者為對象，開展了以下 3項試驗研究普洱茶安全性：試驗1，健康（n=10）和臨界高膽固醇血癥（n=10）的志愿者，每天攝入（0.75 g或1 g）普洱茶提取物，持續(xù)8周；試驗2，健康志愿者（n=10）1次攝入10 g普洱茶提取物研究急性毒性；試驗3，健康志愿者（n=11）每天攝入5 g普洱茶提取物，持續(xù)攝入5周；以上試驗中志愿者無腹脹、腹痛、腹瀉、惡心和脹氣等副作用，8個血液指標（白血球、紅血球、血紅蛋白、紅細胞壓積、血細胞比容、紅細胞平均容量、平均紅細胞血紅蛋白濃度、血小板）和14個生化指標（谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、三磷酸鳥苷、總蛋白、淀粉酶、血糖、總膽固醇、LDL膽固醇、甘油三酯、尿素、血尿素氮、肌酸酐、C型反應性蛋白）無顯著變化。

另外 Kubota等[28]以超重的日本志愿者（n=36）研究普洱茶減肥活性，發(fā)現(xiàn)每天攝入1 g普洱茶提取物，持續(xù)12周，無腹脹、腹痛、腹瀉、過敏等不良反應，測定的血液、生化指標無異常。Chu等[29]發(fā)現(xiàn)代謝綜合征病人（n=45），每天攝入約5 g普洱茶，3個月，除一人腹瀉外，未見其他不良反應，血液、尿液檢查未見異常。Yang等[30]以代謝綜合征患者（n=36），每天攝入1 g普洱茶提取物，持續(xù)3個月，試驗中未觀察到腹痛、腹瀉或過敏癥等不良反應。

在以上研究中，F(xiàn)ujita等[17]、Kubota等[28]和Yang等[30]制備普洱茶提取物的方法相同，流程為100 g茶葉加入900 mL水，100℃提取60 min，2 050×g離心 30 min，濾紙過濾，濃縮，熱風干燥制得粉末。他們的研究均未明確得率，筆者根據(jù)普洱茶速溶粉和茶膏的加工經(jīng)驗推算，其得率可能為20%左右，也即1 g提取物相當于約5 g原茶。因此Fujita等[17]的研究中，每天攝入 5 g普洱茶提取物，推測相當于25 g普洱茶。根據(jù) Fujita等[17]的研究（推測每天約25 g普洱茶，持續(xù)5周）以及Hwang等[27]的報道（每天攝入約20 g原茶的提取物，7 d），筆者認為成人一次性攝入 20 g左右普洱茶是安全的。但是由于大劑量的多酚、咖啡堿等化學物質(zhì)對身體存在副作用，建議適量飲用。

6 結(jié)論

從已有細胞、動物和人體安全性毒理學試驗結(jié)果來看，除孕婦、兒童外，普洱茶具有較高的飲用安全性。但是，茶業(yè)科研、加工人員應當科學認識和重視普洱茶的真菌毒素風險，通過接種安全菌種、實時監(jiān)控發(fā)酵過程等措施改良工藝，控制普洱茶的安全性風險。

[1] 李寧. 國內(nèi)食品安全性毒理學評價的現(xiàn)狀和發(fā)展[J]. 毒理學雜志, 2007, 21(5): 368-370.

[2] 張婧, 張曉鵬, 賈旭東, 等. 我國食品毒理學評價程序和方法標準現(xiàn)況與管理對策[J]. 毒理學雜志, 2015, 29(2):109-113.

[3] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準 食品安全性毒理學評價程序：GB 15193.1—2014[S]. 2014.

[4] 鄭曉燕, 張倩茹. 普洱茶發(fā)酵過程中微生物研究現(xiàn)狀[J].食品安全導刊, 2017, 23: 26-27.

[5] 馬燕, 張冬蓮, 蘇小琴, 等. 茶葉中真菌毒素污染的國內(nèi)外研究概況[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2014, 26(6): 627-630.

[6] 劉勤晉, 陳文品, 白文祥, 等. 普洱茶急性毒性安全性評價研究報告[J]. 茶葉科學, 2003, 23(2): 141-145.

[7] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗. GB 15193.3—2014 [S].2014.

[8] 陳文品, 劉勤晉, 白文祥, 等. 普洱茶毒理學安全性評價研究[Z]. 杭州: 2004, 09.

[9] 陳文品. 經(jīng)典遺傳毒理學試驗表明普洱茶抗癌不致癌[J].普洱, 2012, 5: 80-85.

[10] 龔加順, 陳文品, 周紅杰, 等. 云南普洱茶特征成分的功能與毒理學評價[J]. 茶葉科學, 2007, 27(3): 201-210.

[11] 陳娜, 侯艷, 徐昆龍, 等. 云南普洱茶急性毒性研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報, 2008, 23(2): 233-237.

[12] 胡雪婷. 普洱茶毒理學的初步研究[D]. 武漢: 華中科技大學, 2009.

[13] 馬偉光, 黃之鐠, 游文龍, 等. 配方普洱茶的急性毒性研究[J]. 茶葉科學, 2010, 30(1): 9-12.

[14] Wang D, Xu K, Zhong Y, et al. Acute and subchronic oral toxicities of Pu-erh black tea extract in sprague-dawley rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 134(1): 156-164.

[15] 梁名志, 王麗, 王立波，等. 人工接種真菌固態(tài)發(fā)酵普洱茶的急性毒性安全性評價[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2012, 25(05):1956-1958.

[16] 吳婧, 孫世利, 徐平, 等. 普洱茶抗氧化制劑毒理學研究與安全性評價[J]. 中國茶葉加工, 2014, 4: 18-24.

[17] Fujita H, Yamagami T. Efficacy and safety of Chinese black tea (Pu-ehr) extract in healthy and hypercholesterolemic subjects [J]. Annals of Nutrition and Metabolism, 2008,53(1): 33-42.

[18] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. GB 15193.22-2014 食品安全國家標準 28天經(jīng)口毒性試驗[S]. 2014.

[19] Wang D, Xiao R, Hu X, et al. Comparative safety evaluation of Chinese Pu-erh green tea extract and Pu-erh black tea extract in Wistar rats [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(2): 1350-1358.

[20] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標準 90天經(jīng)口毒性試驗：GB 15193.13—2015 [S].2015.

[21] 李艷艷, 肖蓉, 江波, 等. 普洱茶對SD大鼠血液生理生化指標影響的研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2011, 26(2): 254-259.

[22] 陳文品, 劉勤晉, 白文祥, 等. 普洱茶遺傳毒性安全性評價研究[J]. 茶葉科學, 2005, 25(3): 208-212.

[23] Wu S, Yen G, Wang B, et al. Antimutagenic and antimicrobial activities of Pu-erh tea [J]. LWT - Food Science and Technology, 2007, 40(3): 506-512.

[24] Wang D, Meng J, Gao H, et al. Evaluation of reproductive and developmental toxicities of Pu-erh black tea (Camellia sinensisvar.assamica) extract in Sprague Dawley rats [J].Journal of Ethnopharmacology, 2013, 148(1): 190-198.

[25] 李紅霞, 孫永科, 李艷艷, 等. 普洱茶對原代小鼠肝細胞的毒性初探[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(12): 322-325.

[26] 王迪. 氧化應激介導的喹烯酮遺傳毒性及普洱茶水提取液保護作用研究[D]. 武漢: 華中科技大學, 2011.

[27] Hwang L S, Lin L, Chen N, et al. Hypolipidemic effect and antiatherogenic potential of Pu-Erh tea [M]. ACS Symposium Series, 2003, 859: 87-103.

[28] Kubota K, Sumi S, Tojo H, et al. Improvements of mean body mass index and body weight in preobese and overweight Japanese adults with black Chinese tea (Pu-Erh)water extract [J]. Nutrition Research, 2011, 31(6): 421-428.

[29] Chu S, Fu H, Yang J, et al. A randomized double-blind placebo-controlled study of Pu'er tea extract on the regulation of metabolic syndrome [J]. Chinese Journal of Integrative Medicine, 2011, 17(7): 492-498.

[30] Yang T, Chou J I, Ueng K, et al. Weight reduction effect of pu-erh tea in male patients with metabolic syndrome [J].Phytotherapy Research. 2014, 28(7): 1096-1101.