超高效液相串聯質譜法檢測β興奮劑類快速前處理方法研究

徐春奎 李 艷 陳夢靜 呂曉峰

（鹽城市農產品質量監督檢驗測試中心，江蘇 鹽城 224002）

近幾年，隨著農產品質量安全事件頻發，令人們神經緊繃，農產品質量安全問題已成為社會高度關注的四大問題之一。β-興奮劑類藥物俗稱“瘦肉精”，常用的包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等十幾種物質，目前，此類藥物的主要作用是促進動物蛋白質的合成，加速脂肪的轉化和分解，提高瘦肉率；且在食用組織中以肝、腎、肌肉中沉積較高，一旦被人攝入以后，會產生心跳過快、四肢肌肉顫動、頭暈乏力等神經中樞中毒癥狀，嚴重可導致死亡，對人類健康構成了極大地威脅，因此，我國農業部先后多次發文禁止β-興奮劑類在畜牧生產中使用。

目前國內外已有很多關于動物源性食品中獸藥殘留檢測的分析研究，檢測獸藥殘留儀器主要是速測儀、色譜儀、色譜質譜聯用儀。能夠比較準確定性定量檢測儀器主要是色譜儀和色譜質譜聯用儀。在前處理技術方面，與蔬菜中農藥殘留分析相比，由于肌肉組織基質比較復雜，相對快速簡單地前處理方法在獸藥殘留檢測中應用很有限。筆者長期從事農畜產品檢測工作，本文從2種前處理方法比較來探索液質法檢測β-興奮劑類在豬肝和牛肉基質中快速檢測前處理技術研究，為探索獸藥殘留檢測QuEChERS法建立奠定基礎。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器耗材：Agilent 1290 液相色譜儀，Agilent 6460C三重四極桿質譜儀（配電噴霧離子源）；高速分散器（IKA），離心機（賽默飛），超聲儀（寧波新芝），旋渦混合器（IKA）；固相萃取裝置（天津恒奧，HHE-12B），氮吹儀（北京同泰聯，TTL-DCII），天平（艾德姆，HCB602H），瓶口分液器（德國普蘭德），真空泵（天津恒奧），0.22μm微孔濾膜，固相萃取小柱（500mg/6cc，Waters）。

藥品試劑：7種獸藥為萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、特布他林，對應的同位素內標為萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3、西馬特羅-D7、氯丙那林-D7、妥布特羅-D9、特布他林-D9，均為德國Dr.公司，標準品純度均不低于99%；乙腈、甲醇、正己烷、異丙醇為色譜純（天地），甲酸、乙酸銨、氨水為優級純，β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（Anpel）。

標準溶液配制：分別精密稱取適量的7種獸藥萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、氯丙那林、妥布特羅、特布他林標品，用甲醇分別溶解配制成濃度為1000μg/mL的各藥物標準儲備液；準確吸取100μL的各藥物標準儲備液用甲醇稀釋定容至10mL，配制成濃度為10μg/mL的混標儲備液，再準確吸取100μL的各藥物標準儲備液用甲醇稀釋定容至10mL，配制成濃度為0.1μg/mL的混標工作液。7種同位素內標萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9、沙丁胺醇-D3、西馬特羅-D7、氯丙那林-D7、妥布特羅-D9、特布他林-D9的混合同位素內標溶液配制同上。

1.2 試驗設計

本試驗通過加標回收驗證檢驗檢測方法，思路為設3個濃度梯度，從低到高分別為0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg，每個濃度設3個平行樣，另設空白樣品同時比對。標準曲線配制：標準曲線濃度6個點分別為0.625μg/kg，1.25μg/kg，2.5μg/kg，5μg/kg，10μg/kg、20g/kg。

1.3 樣品前處理過程

方法1（內標法）：準確稱取2.00g（±0.02g）均勻豬肝（或牛肉）試樣，加入適量內標，再加入6.00mL乙腈-異丙醇混合溶液（4∶1，v/v），渦旋混勻后，振蕩10min，10000r/min離心5min，取全部上清液于55℃下氮吹至近干。加入0.2mol/L乙酸銨緩沖液（pH=5.2）2mL，充分溶解，再加入40μL β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，55℃條件下避光水浴振蕩2h左右。取出后至室溫，加甲醇4mL，渦旋混勻，肌肉組織8000r/min離心5min，上清液備用；肝臟組織8000r/min離心5min，上清液轉移至新的離心管，加3mL正己烷，渦旋后，8000r/min離心5min，取全部下清待凈化備用；固相萃取小柱依次用甲醇、2%甲酸溶液各5mL活化，取全部備用液過柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各5mL淋洗抽干，最后用5%氨水甲醇溶液5mL洗脫；洗脫液于50℃下氮吹干，用0.5mL甲醇-0.1%甲酸溶液（1∶9，v/v）復溶，渦旋混勻，過0.22μm有機系微孔濾膜，供上機待測。

方法2（內標法）：準確稱取2.00g（±0.02g）均勻豬肝（或牛肉）試樣，加入適量內標，再加入6.00mL80%乙腈水（含0.3%乙酸），渦旋30s，中速水平振蕩10min，超聲提取5min，8000r/min離心5min，取全部上清液待凈化，以下凈化過程同方法1。

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18 柱 （Rapid Resolution HD 2.1×10 0mm，1.8-Micron）；流 動 相：A相為0.1% （v/v，下同）甲酸水（含5mm的乙酸銨），B相為0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序：0～4.0min，從80%A變為60%A，4.0～4.5min，從 60%A 變為 10%A，4.5～6.0min，保 持 10%A；6.0～6.10min從 10%A 變 為 80%A，6.10～10.00min，保持80%A；流速：0.4ml/min；進樣量：1.0μL；時間：10min；柱溫：30 ℃ 。

1.5 質譜條件

電離模式：電噴霧正離子（ESI+）；毛細管電壓：40kV；離子源溫度：350℃；干燥氣流速：11L/ min，霧化器壓力：45psi；采集方式：多反應監測掃描模式（MRM）；增加電壓（+）：200V。質譜采集參數見表1。

表1 7種β-興奮劑及同位素內標的保留時間、定量離子對、定性離子對、錐孔電壓和碰撞能量

表2 豬肝基質7種β-興奮劑的加標回收情況

表3 牛肉基質7種β-興奮劑的加標回收情況

2 結果與分析

2.1 方法1前處理結果

前處理方法1為江蘇省畜產品例行監測計劃推薦的方法之一。從表2可以看出，方法1在豬肝中添加7種β-興奮劑類藥物，在低濃度（0.5μg/kg）時加標回收率在84.63%～118.59%，RSD在6.71%～12.75%；在中等濃度水平時（1μg/kg）加標回收率在78.56%～112.17%，RSD在1.70%～10.15%；在高濃度水平時（2μg/kg）加標回收率在76.32%～106.80%，RSD在1.57%～8.26%。從表3可以看出，方法1在牛肉中加標回收情況，在低濃度（0.5μg/kg）時加標回收率在100.03%～119.05%，RSD在7.58%～14.15%；在中等濃度水平時（1μg/kg）加標回收率在80.49%～102.77%，RSD在2.18%～8.35%；在高濃度水平時（2μg/kg）加標回收率在81.92%～105.33%，RSD在2.14%～11.53%。

2.2 方法2前處理結果

前處理方法2為筆者實驗室探索方法。從表2可以看出，方法2在豬肝中添加7種β-興奮劑類藥物，在低濃度（0.5μg/kg）時加標回收率在87.64%～117.00%，RSD在3.48%～12.73%；在中等濃度水平時（1μg/kg）加標回收率在80.23%～96.89%，RSD在1.82%～9.83%；在高濃度水平時（2μg/kg）加標回收率在91.58%～109.25%，RSD在2.37%～12.12%。從表3可以看出，方法2在牛肉中加標回收情況，在低濃度（0.5μg/kg）時加標回收率在98.54%～116.63%，RSD在7.88%～12.22%；在中等濃度水平時（1μg/kg）加標回收率在96.07%～108.25%，RSD在0.85%～7.31%；在高濃度水平時（2μg/kg）加標回收率在91.14%～109.52%，RSD在3.15%～11.26%。

2.3 實際樣品檢測

用本試驗的2種方法同時測定2016年第4季度江蘇省畜產品例行監測任務中30份豬肝樣品和10份牛肉樣品。實驗結果表明，2種方法測定的樣品中7種β-興奮劑均為陰性。同時各做1份豬肝和牛肉加標為陽性樣品，2種前處理方法結果均在2.00μg/kg左右，均判斷為陽性。

3 討論

QuEChERS法自2003年由Anastassiades等提出以來，廣泛的應用于農獸藥殘留檢測分析，但是在動物源性食品檢測中應用較少。QuEChERS法步驟相對簡單，也比較深得檢測人員的青睞。根據江蘇省畜產品例行監測β-興奮劑類判定值為 1μg/kg，筆者從 0.5μg/kg、1μg/kg、2μg/kg 3個濃度梯度設計試驗，采用在空白豬肝和牛肉樣品中添加藥物計算回收率來評價前處理效果，由表2和表3可以看出，檢測β-興奮劑類殘留的2種前處理方法的回收率均比較穩定，在76.32%～119.05%的范圍內，且RSD均在15%之內，且7種藥物標準曲線在0.625%～20μg/kg范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99，均符合檢測技術方法要求。但是方法1前處理一個樣品需要花費時間在4h左右，主要是因為酶解時間比較長，筆者也嘗試過乙腈-異丙醇混合溶液（4∶1，v/v）提取，省略酶解步驟的前處理，但是結果不是特別理想，尤其是對萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等苯酚型結構的藥物影響較大，加標回收結果不是很滿意。方法2采用酸化的乙腈水經過振蕩超聲充分提取，用固相填料進行萃取凈化，快速簡潔，一般前處理一個樣品需要花費1h左右，與方法1相比，大大節約了時間，達到了省時省力的效果，最重要的是，2種前處理方法加標回收結果均比較穩定，且結果比較接近，均比較滿意。

4 結論

本研究以江蘇省例行監測畜產品參數為依據，探索定性定量檢測β-興奮劑類獸藥殘留相對簡單省時省力的前處理方法。與省例行監測β-興奮劑類檢測建議使用的標準或方法相比，筆者探索了一種相對簡單的前處理方法，并具有同等效果的檢測結果。為從事畜產品檢測工作的檢測人員提供了篩選方法，有助于檢測機構快速準確檢測獸藥定性定量分析，并為日常監控提供依據。

[1]葉妮,孫雷,尹暉,等.UPLC-MS/MS法檢測動物性食品中19種β-受體激動劑殘留[J].中國獸藥雜志,2015,49(9):51-59.

[2]農業部1025號公告-18-2008,動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜——串聯質譜法[S].中華人民共和國國家標準.