空腸彎曲菌脂多糖對大鼠脊髓髓鞘損傷的實驗研究

，，，，

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，Cj)是常見的人獸共患細菌性腸道病原菌，臨床約90%的急性細菌性腸炎均與該菌相關。同時，Cj感染是導致格蘭-巴利綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)的主要病因之一。大量的臨床和動物實驗研究證實，Cj感染后血清中出現被激發抗GM1和抗GDla等抗神經節苷脂自身抗體，從而導致周圍神經損傷，認為自身免疫性炎癥是GBS病變機制之一[1]。目前尚不清楚空腸彎曲菌脂多糖(Cj-LPS)是否會引起髓鞘損傷。本研究中，我們分別用Cj-LPS和特異性LPS抗體免疫大鼠，觀察大鼠脊髓形態學變化，神經營養因子-3(NT-3)及其受體TrkC和神經生長抑制因子NogoA及其受體NgR mRNA的表達，探討Cj-LPS對大鼠脊髓髓鞘損傷的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 60只SPF級雄性Wistar大鼠，體重200～300 g，由浙江大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(浙)2012-0178。將大鼠隨機分為對照組(NC組)，脂多糖組(Cj-LPS組)，及LPS抗體組(Anti-LPS組)。每組各20只大鼠。

1.2Cj-LPS，抗LPS試劑的制備及動物免疫 Pennor O∶19型空腸彎曲菌菌種購于美國菌種保藏中心(ATCC)，厭氧培養。使用Westphal熱酚水法提取LPS，其純度通過考馬斯亮藍染色鑒定達到99%。通過親和層析法制備LPS抗體。稱取2 g環氧樹脂活化的瓊脂糖凝膠6B和8 mg LPS填充制備層析柱，將硫酸銨處理的Cj特異性免疫血清上柱層析，收集洗脫液并立即透析，濃縮儲存待用。

Cj-LPS組以LPS、完全弗氏佐劑、生理鹽水溶液混勻充分乳化后，腹股溝、背部皮下多點注射。對照組以等容的完全弗氏佐劑、生理鹽水和生理鹽水皮下注射。分別在初次免疫后1周、2周時，同樣方法加強免疫。LPS抗體組分別于實驗2、3周，取大鼠特異性抗CjLPS IgG加等量不完全弗氏佐劑，乳化后，于小腦延髓池注射。

1.3樣品采集 隨機抽取每組大鼠中的10只，在第4周即免疫誘導后的急性期進行處死，另外10只則在第6周通過腹腔注射水合氯醛進行麻醉，打開胸腔暴露心臟，由左心室插入導管致主動脈，快速注入200 mL生理鹽水，然后緩慢注入200 mL多聚甲醛(40 g/L)。之后取脊髓組織，固定，常規脫水，石蠟包埋切片。進行蘇木精-伊紅(HE)染色并在光學顯微鏡下觀察其組織形態變化。

1.4實時定量PCR 根據標準程序進行RNA提取及cDNA合成(表1)。如文獻[2]所述進行定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)來檢測分析NT-3/TrkC和NogoA/NgR mRNA的表達。

使用RNA提取試劑盒從大鼠脊髓中提取總RNA，并通過市售試劑盒逆轉錄生成cDNA，操作方法遵循試劑盒說明書(北京天根生化科技限公司)。使用ABI 7300 PCR儀(美國Applied Biosystems)及SYBR Green PCR Master Mix(北京天根生化科技限公司)進行qRT-PCR測定。20 μL實時反應混合液中含有：實時PCR SYBR混合液(2×)10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，模板0.5 μL，以及DEPC水。反應條件如下：NT-3/TrkC：95 ℃初始變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，每兩個循環降溫1 ℃，共40個循環，然后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。NogoA/NgR：95 ℃初始變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共40循環；然后4 ℃保存。使用△△Ct分析法對數據進行分析。使用delta循環時間法進行定量分析。使用比較(2-△△Ct)法對每個樣品中的目標基因相對于β-actin基因進行標準化處理[3]。

表1 qRT-PCR引物序列

Tab.1 Primer sequences used for qRT-PCR

基因引物序列產物大小/bpβ-actin上游5′CATCCGTAAAGACCTCTATGC-CAAC3′171下游5′ATGGAGCCACCGATCCACA3′NT-3上游5′CATGTCGACGTCCCTGGAA-AT-AG3′124下游5′GGATGCCACGGAGATAAG-CAA3′TrkC上游5′ATCACTGTGACCCACAAAC-CAGAG3′124下游5′ACCGGCGACCATACTTGTTGA3′NogoA上游5′CTTGGTCATGTGAACAGCA-CAATAA3′124下游5′CATTGAACAAGGCACCAAC-GTAA3′NgR上游5′TCCAGTCATGCCGAAATCT-CAC3′144下游5′TGGTAGGGTCCACGACATG-AAG3′

2 結 果

2.1大鼠脊髓HE染色結果 NC組大鼠脊髓無可見異常變化(圖1A和D)。而Cj-LPS組則在第4周和第6周時發現病理變化，主要表現為小靜脈及毛細血管周圍不同程度的炎性細胞浸潤，呈套袖狀變化；并出現脫髓鞘改變，神經細胞核固縮、變性及壞死(圖1B和E)。與Cj-LPS相比，LPS抗體組的病理變化有不同程度緩解，例如浸潤細胞數量較少，套袖狀變化程度較低，神經元損傷有所恢復(圖1C和F)。

圖1 大鼠脊髓組織病理學圖(HE染色，×200)Fig.1 Histopathologic of the spinal cord in rats (HE staining, ×200)

2.2NT-3/TrkC mRNA的表達 與NC組相比，第4周時Cj-LPS組和Anti-LPS組NT-3 mRNA的表達均明顯下調(P<0.01)。與Cj-LPS組比較，第4周時Anti-LPS組NT-3 mRNA的表達無統計學差異(P>0.05)，但第6周時Anti-LPS組NT-3 mRNA的表達明顯上調(P<0.05)(圖2A)。

第4周及第6周時，Cj-LPS組大鼠脊髓TrkC mRNA的表達均低于NC組，有統計學差異(P<0.05)，而第6周時Anti-LPS組TrkC mRNA的表達顯著增加有統計學意義(P<0.01)(圖2B)。

A：大鼠脊髓中NT3 mRNA的表達；B：大鼠脊髓中TrkC mRNA的表達。數據表示為與NC組比較。#P<0.05，##P<0.01，與Cj-LPS組比較。圖2 第4周和6周時大鼠脊髓中NT-3 mRNA和TrkC mRNA的表達Fig.2 Expressions of NT-3 mRNA and TrkC mRNA in rat spina cord after 4 weeks and 6 weeks

2.3NogoA/NgR mRNA的表達 與NC組相比，Cj-LPS組大鼠脊髓NogoA mRNA的表達在第4周和第6周均有所增加。第6周時Anti-LPS組NogoA mRNA的表達則明顯低于Cj-LPS組(圖3A)。

與NC組相比，Cj-LPS組NgR mRNA的表達在第4周和第6周均有有統計學差異(P<0.01)。第6周時Anti-LPS組與NC組間NgR mRNA的表達也有統計學差異(P<0.01)。但第4周和第6周時，Cj-LPS組與Anti-LPS組間NgR mRNA的表達并無統計學差異(圖3B)。

A：大鼠脊髓中NogoA mRNA的表達；B：大鼠脊髓中NgR mRNA的表達。數據表示為與NC組比較。#P<0.05，##P<0.01，與Cj-LPS組比較。圖3 第4周和6周后大鼠脊髓中NogoA mRNA和NgR mRNA的表達(RT-PCR)Fig.3 Expressions of NogoA mRNA and NgR mRNA in rat spinal cord after 4 weeks and 6 weeks

3 討 論

空腸彎曲菌的細胞壁主要由LPS組成，即多糖O抗原、核心多糖及類脂A，具有內毒素特性。多糖O抗原是空腸彎曲菌的主要表面抗原，國際上空腸彎曲菌penner血清學分型方法就是來源于此。研究發現，penner O∶19型空腸彎曲菌的LPS成分與人類周圍神經的神經節苷脂間存在分子模擬現象，由各種類型的神經節苷脂抗體特異性地出現在相應的GBS亞型中[4]。

P2堿性蛋白為中樞和周圍神經髓鞘的共有成分，用P2堿性蛋白免疫動物可同時誘發實驗性變態反應性神經炎(EAN)和實驗性變態反應性腦脊髓炎(EAE)，有研究發現可能是針對P2堿性蛋白產生的自身免疫性T細胞和自身抗體會在周圍神經和中樞神經系統均引起免疫應答，導致周圍和中樞的共同脫髓鞘，并在局部產生細胞因子，破壞血腦屏障，引起腦水腫及腦脊髓損害[5]。本研究首先表明Cj-LPS可誘導實驗大鼠脊髓的病理組織學變化，并發現抗LPS抗體可改善這一病理組織學變化。至今已有眾多基礎研究結果表明Cj-LPS是一種最常見的感染試劑，Cj-LPS也被歸類為致神經病變試劑[6]。本研究中，我們檢測了神經營養因子NT-3及其受體TrkC mRNA的表達及神經過度生長抑制因子NogoA/NgR mRNA的表達，發現Cj-LPS可降低NT-3/TrkC mRNA的表達并增加NogoA/NgR mRNA的表達。

神經營養因子(NTFs)和神經生長抑制劑都可影響神經再生。NTFs屬于分泌性多肽生長因子家族，其具有神經系統的各種生理功能。它們可參與神經的可塑性調節及神經傳遞，促進受傷髓鞘的修復和再生，以此減輕脊髓損傷后的繼發性損傷程度。NT-3在神經元髓鞘發育中起著非常重要的作用。NT-3可促進神經損傷之后髓鞘磷脂的分化和延伸，并在髓鞘生長中發揮引導性作用[7]。NT-3可與位于靶細胞表面并具有酪氨酸激酶活性高親和力受體TrkC相結合，建立具有生物作用的信號轉導途徑[8]。我們的實驗結果表明，Cj-LPS可降低NT-3/TrkC mRNA的表達，這一作用從第4周到第6周表現尤為顯著，可見Cj-LPS誘導大鼠發生了不可逆髓鞘損傷。

NogoA是與髓鞘相關的神經突增生抑制劑，其家族包含3種亞型[9]。有研究表明，31%的感染性疾病歸均由Cj-LPS所致，而它也可能是GBS的病因之一[10]。近一個世紀來學者們公認GBS與急性多發性神經炎相關。急性多發性神經炎是一種涉及外周神經和神經根的脫髓鞘病，具有小血管的炎性細胞浸潤這種自身免疫性外周神經病變的病理特征之一。它被稱為急性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病。通過文獻檢索我們發現NogoA與中樞神經系統自身免疫性脫髓鞘性疾病密切相關[11]。由NgR介導的信號轉導取決于其與低親和力神經生長因子受體p75NTR的關聯，該受體p75NTR也是神經營養因子受體Trk家族的共受體。最近的研究表明，髓鞘相關糖蛋白(MAG)和髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(OMgp)和Nogo-66一樣，都可結合NgR并激活RhoA，通過p75NTR來轉導神經突生長抑制信號[12]。通過中和抗NogoA抗體，使用NgR競爭性拮抗肽或截短的可溶性NgR，均可在體內阻斷NgR與其受體之間的相互作用，因而誘導遠距離軸突再生、補償性生長、及上調生長相關基因；同時也可加強損傷后中樞神經系統功能的恢復[13]。

綜上所述，我們發現Cj-LPS可減少神經營養因子的表達、增加神經抑制因子的表達，以此誘導髓鞘損傷；而特異性抗LPS抗體可改善脊髓髓鞘病理變化。

[1] Ogawa G, Kaida K, Kuwahara M, et al. An antibody to the GM1/GalNAc-GD1a complex correlates with development of pure motor Guillain-Barré syndrome with reversible conduction failure[J]. J Neuroimmunol, 2013, 254(1-2): 141-145. DOI: 10. 1016 / j. jneuroim. 2012. 09. 005

[2] Wang Y, Kilic E, Kilic U, et al. VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena[J]. Brain, 2005, 128 (Pt 1): 52-63. DOI: 10. 1093 / brain / awh325

[3] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2012, 25(4): 402-408. DOI: 10.1006 / meth. 2001. 1262

[4] Poropatich KO, Walker CL, Black RE. Quantifying the association betweenCampylobacterinfection and Guillain-Barré syndrome: a systematic review[J]. J Health Popul Nutr, 2010, 28(6): 545-552. DOI: 10. 3329 / jhpn. v28i6. 6602

[5] Brambilla R, Morton PD, Ashbaugh JJ, et al. Astrocytes play a key role in EAE pathophysiology by orchestrating in the CNS the inflammatory response of resident and peripheral immune cells and by suppressing remyelination[J]. Glia, 2014, 62(3): 452-467. DOI: 10. 1002 / glia. 22616

[6] Zhang M, Li Q, He L, et al. Association study between an outbreak of Guillain-Barre syndrome in Jilin, China, and precedingCampylobacterjejuniinfection[J]. Foodborne Pathog Dis, 2010, 7(7): 913-919. DOI: 10. 1089 / fpd. 2009. 0493

[7] Kamei N, Tanaka N, Oishi Y, et al. BDNF, NT-3, and NGF released from transplanted neural progenitor cells promote corticospinal axon growth in organotypic cocultures[J]. Spine, 2007, 32(12): 1272-1278. DOI: 10.1097 / BRS. 0b013e318059afab

[8] Duprey-Díaz MV, Blagburn JM, Blanco RE. Neurotrophin-3 and TrkC in the frog visual system: changes after axotomy[J]. Brain Res, 2003, 982(1): 54-63. DOI: 10. 1016 / S0006-8993 (03) 02948-2

[9] Chen MS, Huber AB, Haar ME, et al. Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J]. Nature, 2000, 403(6768): 434-439. DOI: 10. 1038 / 35000219

[10] Israeli E, Agmon-Levin N, Blank M，et al. Guillain-Barré Syndrome-a classical autoimmune disease triggered by infection or vaccination[J]. Clinical Rev Allergy Immunol, 2012, 42(2): 121-130. DOI: 10. 1007 / s12016-010-8213-3

[11] Mao YS, Lu CZ, Wang X, et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats by a viral peptide with limited homology to myelin basic protein[J]. Exper Neurol, 2007, 206(2): 231-239. DOI: 10.1016 / j. expneurol. 2007. 04. 015

[12] Wang KC, Kim JA, Sivasankaran R, et al. p75 interacts with the Nogo receptor as a co-receptor for Nogo, MAG and OMgp[J]. Nature, 2002, 420(6911): 74-78. DOI: 10. 1038 / nature01176

[13] Fournier AE, Gould GC, Liu BP, et al. Truncated soluble Nogo receptor binds Nogo-66 and blocks inhibition of Axon growth by myelin[J]. J Neurosci, 2002, 22 (20): 8876-8883.