云南省師宗縣牛羊藍舌病病毒感染情況及活動規律監測

，， ， ，，，華春

藍舌病(Bluetongue,BT)是一種由呼腸孤病毒科環狀病毒屬的藍舌病病毒((Bluetongue Virus, BTV)引起的，通過昆蟲庫蠓(Culicoides)傳播的非接觸性反芻動物傳染病[1-2]，動物感染BTV的平均死亡率為30%，綿羊高達80%[3]。OIE將其列為須通報疾病，我國歸為一類動物疫病。BT流行廣泛，目前尚無有效的治療方法[4]，當BTV的不同血清型毒株在同一區域同時流行時，容易發生基因重組，全球共有27種不同的BTV血清型，在中國已有BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-12、-15、-16、-21、-24等11種血清型被分離報道[5]，不同血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護給BTV的防控帶來了嚴峻挑戰[6-7]。

云南省師宗縣地處滇中地區，有亞熱帶與溫帶共存的氣候特征，冬春季受大陸季風的影響，晴天偏多，光照充足，氣候溫和干燥，夏秋季受海洋季風的影響，陰雨偏多，光照差，氣候溫涼潮濕。總的情況是終年溫和，雨熱同期，干濕分明，非常適宜蚊蟲生長[8-10]。云南BTV的傳播與媒介昆蟲、地理環境、氣候變化都緊密相關[11]，1979年張念祖等在云南省師宗縣首次分離到藍舌病病毒，從而確定本病在我國的存在[12]。1995年由12頭BTV抗體陰性黃牛組成的監控群在師宗縣建立，隨后監控動物轉陽，成功分離到藍舌病病毒。2012年肖雷等[13]在師宗縣分離獲得67株藍舌病病毒，可見云南省師宗縣是藍舌病高發地區。為了解近年來云南師宗縣藍舌病病毒活動情況，參照澳大利亞病毒監測模式[14]，自2014年起，連續3年在云南省師宗縣五龍鄉建立監控群，每年設立監控動物15只，從5-10月，每周采血一次，11月、12月，每月采血1次，每份血清樣品經BTV C-ELISA檢測，連續的血清學檢測數據可得出師宗縣近3年來藍舌病病毒的感染情況以及病毒活動的時間規律，每份血液樣品盲傳分離病毒，根據3年分離獲得的藍舌病毒株數量及病毒的血清型，可推測出當地流行的藍舌病主要血清型，對藍舌病的預警、風險評估、流行病的研究起到重要作用。

1 材料與方法

1.1 監控群建立

1.1.1監控動物的選擇 因藍舌病病毒可引起綿羊發病和死亡，而牛和山羊多為隱性感染，所以2014-2016年每年4月篩選年齡小于1歲且藍舌病抗體檢測為陰性的10頭健康黃牛和5只健康山羊為監控動物設立監控動物群，3年累計設立監控群3個，監控動物45頭。

1.1.2監控動物的管理 篩選出來的監控動物用耳標進行專門標識，與其它牛羊混群放牧，禁止使用殺蟲藥。

1.1.3采血 每年的5月到10月，每周采血1次，11月、12月，每月采血1次，每頭監控動物每次采集常規全血、肝素抗凝血各1管(10 mL)，常規全血分離獲得血清，-20 ℃保存，用于血清學檢測，肝素抗凝血，4 ℃保存，用于病毒分離。

1.2 血清學監測

1.2.1實驗材料 BTV C-ELISA檢測試劑盒由云南省畜牧獸醫科學院熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供，并僅限實驗室使用[15]。

1.2.2檢測方法 按檢測樣品數量取出2 ℃～4 ℃保存的ELISA板，置室溫15 min，并編號；根據編號每孔加入50 μL 10%稀釋的待檢血清和陰性、陽性、弱陽性對照血清各2孔，空白對照加4空；同時按每孔50 μL加入競爭抗體，此時每孔共100 μL液體，空白對照用稀釋液補充至100 μL，震蕩混勻后置37 ℃溫箱里溫育60 min；取出溫育好的板，用PBST洗液洗板2次，在吸水紙上輕輕拍干；每孔加入50 μL酶標二抗工作液震蕩混勻后置37 ℃溫箱里溫育30 min；用PBST洗液洗板5次，吸水紙上輕輕拍干；每孔加50 μL底物反應液，37 ℃避光溫育10 min，每孔再加終止液50 μL終止反應，37 ℃避光顯色15 min ，讀取OD450nm值。

1.2.3結果判定 檢測合格條件：兩個陽性對照孔OD450≤0.2，兩孔間OD450差距小于0.05，兩個陰性對照空孔OD450≥1.0且<1.6，兩孔間OD450差距小于0.2。

按照抑制率(PI)=(陰性對照OD450平均值-樣品血清OD450)/陰性對照OD450平均值×100%，抑制率≥50%時判為抗體陽性，否則為陰性。

1.3 病毒分離

1.3.1樣品準備 在1.5 mL微量離心管中加入1 mL PBS、200 μL肝素抗凝血紅血球，顛倒混勻5次；1 000 r/min離心10 min，輕輕吸棄上清；加入800 μL滅菌雙蒸水，渦旋混勻，確保紅細胞充分裂解，準備好的樣品作為接種液備用。

1.3.2接種細胞 將長成單層的BHK-21細胞瓶，根據血液樣品編號對細胞瓶進行編號，每個樣品標記2瓶；棄去細胞瓶中的培養液，取500 μL接種液接種到相對應的細胞瓶內，每個樣品接種2瓶，置37 ℃培養箱感作1 h后加入10mLMEM維持液，再置37 ℃培養箱中培養7 d，每天觀察細胞病變情況，與對照細胞相比，病變程度以+、++、+++表示，有25%細胞出現CPE時記做+，50%細胞出現CPE時記做++，75%細胞出現CPE時記做+++；連續在BHK-21細胞上傳3代，出現CPE的細胞瓶4 ℃保存，擴大培養，存于-80 ℃冰箱，待鑒定；3代都無CPE的細胞瓶視為病毒分離陰性，可棄之。

1.4 陽性分離物鑒定

1.4.1提取陽性分離物的RNA 取接毒后CPE達到70%的單層培養BHK-21細胞，按TRizol試劑盒方法抽提總RNA。

1.4.2引物的設計與合成 根據基因庫提供的BTV各基因序列，通過分析軟件，對BTV較為保守的RNA7(VP7基因)片段設計引物[9]：

BTV-S7-A：5′-GTTACAATGCGCCCGACATC-3′

BTV-S7-B：5′-TGTAATGCGGCCTGTCCAT-3′

擴增產物長度為555 bp。引物由大連天寶生物工程公司合成，用RNase-free ddH2O稀釋成20 pmol/μL備用。

1.4.3病毒雙鏈RNA變性 在PCR反應管中加入所提取的核酸樣品10 μL，甲酰胺5 μL，95 ℃ 5 min，速取出置冰上。

1.4.4cDNA的制備 在PCR反應管中加入變性好的模板RNA 8 μL，下游引物1 μL，dNTP Mixture 1 μL，65 ℃保溫10 min，冰浴2 min，置于冰上；加入10 μL提前配好混勻的反應5×PrimeScript Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，PrimeScript Reverse Transcriptase(200 U/μL)1 μL，RNase free dH2O 4.5 μL，此時PCR反應管里共有液體20 μL，混勻后，42 ℃ 60 min，70 ℃保溫15 min后冰上冷卻，得到的cDNA溶液，-20 ℃保存備用。

1.4.5病毒的RT-PCR鑒定 以cDNA為模板，在50 μL PCR體系中完成反應，反應參數為95 ℃ 52 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個偱環；72 ℃ 5 min，4℃ 保持。取PCR擴增產物5 μL與1 μL 6×DNA上樣Buffer混勻，點樣于12 g/L瓊脂糖凝膠上樣孔中，80 V電泳30 min，置于凝膠成像系統中紫外光照射，觀察記錄結果。

1.4.6病毒血清型的鑒定 Karber方法計算TCID50，應用南非參考毒株標準血清按《澳大利亞動物疫病診斷技術標準》進行中和試驗[16]。

2 結 果

自2014年建立監控群以來，共計采血80次，收集監控動物血清1 200份，所有血清均在采血后1周之內進行BTV C-ELISA檢測，監控動物抗體轉陽后，抗體陽性持續5周以上，監測數據連續可靠。統計監控動物血清藍舌病抗體檢測結果，3年均有動物感染，2014年感染率60%，2015年感染率為33.33%，2016年感染率為13.33%；黃牛感染率略高于山羊感染率(表1)。

表1 2014-2016年監控動物藍舌病感染情況統計

Tab.1 Natural infection rate of bluetongue disease in sentinel animals from 2014 to 2016

時間采血次數動物種類動物數量感染動物數量感染率2014年28次黃牛10770%山羊5240%2015年25次黃牛10220%山羊5360%2016年27次黃牛10220%山羊500%

統計3年的監控動物藍舌病抗體檢測結果，監控動物感染BTV的時間均在6-10月之間，其中以7月和10月感染動物最多，且7月連續3年都有動物感染(圖1)。

圖1 2014-2016年監控動物感染BTV的數量和感染時間統計圖Fig.1 Number of sentinel animals infected with BTV and the time of infection during 2014-2016

16個感染BTV的監控動物中有7個分離到病毒，共9株，BTV對BHK-21細胞上的病變產生明顯的細胞病變，細胞病變產生比較迅速，接種BHK-21細胞24 h就可以觀察到明顯細胞病變，48 h CPE可達到70%以上，細胞病變特點為變圓、腫脹、脫落(圖2)。

A:正常BHK-21細胞；B:感染BTV 48 h后的BHK-21細胞圖2 BTV對BHK-21細胞的致病變作用Fig.2 CPE of BHK-21 cells infected with BTV

2014年在3頭感染黃牛紅細胞內分離獲得4株BTV共3個血清型，分別為BTV-2、4、12型，感染山羊紅細胞內未能獲得分離毒株；2015年在1頭感染黃牛紅細胞內分離獲得1株BTV，鑒定為BTV-9型，在3只感染山羊紅細胞內分離獲得4株BTV，均為BTV-16型；2016年未能獲得分離毒株(表2)。

表2 2014年-2016年BTV分離鑒定情況統計

Tab.2 Isolation and identification of the BTV details during 2014-2016

時間分離毒株數量病毒編號血液樣品編號血清型鑒定動物耳號采血時間2014年4株V07310933BTV-4黃牛5號2014.9.2V11310939BTV-2/12黃牛21號2014.9.2SZ111428BTV-4黃牛2號2014.9.232015年5株SZ214903BTV-9黃牛20號2015.6.30V15014933BTV-16山羊2號2015.7.7V14915259BTV-162015.7.21SZ316860BTV-16山羊3號2015.10.13SZ416979BTV-16山羊4號2015.10.202016年0株/////

2012年在師宗縣分離的藍舌病病毒包含7個血清型，分別為BTV-1、BTV-3、BTV-5、BTV-9、BTV-12、BTV-16、BTV-24型，2014年新增了2個血清型BTV-2、BTV-4型。(圖3)

圖3 近年來師宗縣分離藍舌病毒株的血清型統計圖Fig.3 Serotype of the BTV was isolated in Shizong County

3 討 論

2008-2009年云南省境內地區牛、羊藍舌病的感染率為23.0%，其中師宗縣370份羊血清中，BTV抗體陽性率為0%[17]。本次監測實驗由于監控動物是在自然界放牧飼養管理，干擾試驗結果因素較多，且監控動物數量有限，因此在檢測結果中出現了2016年山羊感染率為0%的情況，但2016年的黃牛感染率為20%，證明2016年仍有藍舌病病毒活動，且3年平均牛、羊感染率為35.56%，遠高于2008-2009年的調查結果，說明藍舌病病毒在師宗縣長期存在并有活躍的趨勢。

藍舌病是由庫蠓傳播的一種蟲媒病毒病，因此藍舌病的活動規律主要取決于庫蠓的活動情況，1991年李華春等在調查藍舌病傳播媒介庫蠓時，曾報道云南省師宗縣多在7-10月發生藍舌病[18]，與本次監測結果一致。庫蠓在6月上旬開始活動，7-9月是活動高峰期，這樣的季節性消長規律使藍舌病的流行也具有明顯的周期性和季節性，也提示了藍舌病的防控關鍵時期是每年的6-10月，且殺蟲滅蚊尤其重要。

2014-2016年，有16個監控動物感染BTV，從其中7個感染動物的紅細胞內分離到9株BTV，包含5個血清型，病毒分離效率較高，證明本研究的病毒分離方法成熟。2014年21號黃牛紅細胞內同時分到2株病毒，且為不同的血清型，該黃牛可能被同時攜帶兩個血清型的媒介昆蟲叮咬，也可能是兩個攜帶不同血清型的媒介昆蟲在1周之內都叮咬了該黃牛[19]。2015年2號山羊紅細胞內分離到BTV-16型毒株，時隔兩周又分離到同一毒株，證明BTV在動物紅細胞中至少存活14 d。

2012年，在師宗縣分離到的BTV毒株已包含7個血清型，2014年增加至9個，其中BTV-5、-9、-24為我國首次發現[20]，可能還有未被發現的血清型，說明師宗縣存在多種血清型的BTV流行，且以BTV-3、BTV-5、BTV-16為優勢血清型。多種血清型同時存在，型與型之間無交叉保護，這給藍舌病的防治帶來了嚴峻考驗，不僅需要繼續對BTV感染情況及活動規律進行研究，還急需開展藍舌病血清型滅活疫苗、新型疫苗研究，開發多價藍舌病通用疫苗，建立疫苗生產技術儲備[21]。

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