三氧化二砷對慢性粒細胞白血病Hedgehog信號轉導通路分子蛋白表達的影響

馬詠歌，宋鵬，葉向梅，趙輝，劉志宇，張麗坤，剛宏林,3，楊東光*(.黑龍江中醫藥大學， 黑龍江 哈爾濱 50040；.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院中心血液實驗室，黑龍江 哈爾濱 5000；3.哈爾濱食品藥品檢驗檢測中心， 黑龍江 哈爾濱 5005)

三氧化二砷(Arsenic trioxide, ATO)，又名亞砷酸，為中藥砒霜提取物，有劇毒，用于治療慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)歷史悠久，是最早的抗CML藥物。Hedgehog(Hh)通路是胚胎發育過程中的關鍵信號通路之一，但是Hedgehog通路成分的改變往往與人類惡性腫瘤的發展有關[1]。研究表明Hh通路在部分CML患者中異常活化，CML的靶向性治療藥物伊馬替尼(Imatinib mesylate,IM)對該通路無抑制作用，因此，該通路是IM耐藥細胞賴以生存的重要信號轉導通路。

目前，研究的Hh信號抑制劑均以Smoothened(Smo)為靶點，其藥理活性較Smo的天然抑制劑環巴胺(Cyclopamine)有所提高，在治療CML的臨床前研究中獲得了滿意的療效[2]。但作為新研發的小分子藥物，在其走向臨床之前，需要進行臨床前研究以評價其安全性。其次， Smo抑制劑的應用誘發患者和鼠模型編碼Smo蛋白的基因發生突變，這些突變嚴重阻礙了Smo抑制劑與該蛋白的結合能力，導致患者對該療法耐藥[3]。此外，Smo下游分子Gli2 和cyclin D1的直接活化，可以繞過Smo抑制劑的作用靶點，是Smo抑制劑耐藥的另外一個原因[4]。所以，由于缺乏臨床應用經驗及以Smo為靶點，目前的Hh通路抑制劑尚無法在CML患者中廣泛應用。

近年來隨著醫學水平的提高以及分子生物學的進展，ATO已經較為普遍地運用于腫瘤疾病的治療上，并展現出較好的治療效果。而且我們發現，ATO的應用可預防IM耐藥的發生。ATO 在2010年被認定為Hh通路的靶向性抑制劑，我們率先在應用ATO治療并獲得滿意療效的急性早幼粒細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)患者上進行了ATO對Hh通路抑制作用的驗證。這為ATO應用于CML的IM耐藥的治療提供了理論上的可能性。但ATO對CML干細胞及其Hh通路的抑制作用及靶點尚未闡明。本研究以CML細胞株K562為模型，初步探討ATO對CML細胞Hh通路關鍵蛋白表達的抑制作用及機制，為該藥應用于CML的臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人類CML細胞株K562，為本實驗室長期培養。ATO注射液(10 mg/10 mL)，由哈爾濱伊達藥業提供。TRIzol，invitrogen公司。逆轉錄試劑盒，PROMEGA公司。Fast Start Universal SYBR Green PCR Master實時定量PCR試劑盒，羅氏公司。RIPA強裂解液，碧云天公司。抗c-Abl抗體(sc-56887)，Santa Cruz公司。堿磷顯色二抗，Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 人類CML細胞株K562培養與處理

K562細胞使用含10%胎牛血清(杭州四季青)和濃度為100 IU/M青鏈霉素(Invitrogen)的1640培養基中(Gibco)，置于37℃細胞培養箱中長期培養。ATO注射液(10 mg/10mL)，由哈爾濱伊達藥業提供。實驗時，使用不同濃度的ATO溶液連續作用于K562細胞48 h，并收集細胞，做下一步檢測。

1.2.2 Annexin-V/PI雙染檢測細胞調亡

收集經過濃度分別為0、1、2、4、8μM的ATO處理的K562細胞，經用PBS洗滌、AnnexinV-FITC染色后，在室溫避光靜止15 min后每管再加入1×binding buffer 400 μL，在1 h內上流式細胞儀進行凋亡檢測。每份樣品同設3份，求平均值和標準差。

1.2.3 免疫印跡

收集經過濃度分別為0、1、2、4 μM的ATO處理的K562細胞，采用RIPA強裂解液(150 mM NaCl, 1% w NP-40, 0.5%[w/v]sodium deoxycholate, 0.1%[w/v]sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 mM Tris HCl [pH=8], 10 mM EDTA, and 1 mM PMSF)(碧云天)提取蛋白后進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后，用蛋白轉移裝置將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，按轉移蛋白的常規方法進行。轉移結束后，進行免疫印跡、堿磷顯色及灰度分析。采用抗體為抗Gli2抗體(C-10)(Santa Cruz)，抗Gli1抗體(Abcam)， 抗Smoothened抗體(Abcam)，抗Patched/PTCH 抗體(Abcam)and抗-actin抗體 (Santa Cruz)，及堿磷顯色二抗 (Amersham)。

1.2.4 統計學處理

2 結果

2.1 ATO對K562細胞的誘導凋亡作用

經不同濃度的ATO處理后，CML細胞K562逐漸出現了凋亡現象，ATO誘導K562細胞出現凋亡呈藥物劑量依賴性(見圖1)。但值得注意的是，K562對ATO的敏感性較低，2 μM的ATO僅能誘導少量CML細胞發生凋亡。

圖1 在48 h內不同濃度ATO誘導K562細胞凋亡效果

2.2 ATO對K562細胞Hh信號轉導通路分子蛋白水平的影響

經不同濃度的ATO連續作用于K562細胞株48 h后，我們檢測了K562細胞Hh信號轉導通路分子的蛋白表達情況。結果發現，ATO 對Hh通路的核心蛋白Gli2蛋白表達具有顯著的抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05)(見圖2)。ATO對于Hh通路的抑制因子ptch2的表達具有一定的促進作用(高劑量呈抑制作用)，但無劑量依賴性(P>0.05)。但ATO對于Gli1蛋白，無論何種劑量，在48 h的作用時間內，均未對其蛋白表達水平產生顯著的抑制作用(P>0.05)(見圖3)。

圖2 在ATO處理組和對照組中Gli2蛋白的表達情況注:與對照組比較，P<0.05

圖3 在ATO處理組和對照組中ptch2、Gli1蛋白的表達情況注:與對照組比較，P>0.05

3 討論

《本草圖經》云:“砒霜，舊不著所出郡縣，今近銅山處亦有之，惟信州者佳。其塊有甚大者，色如鵝子黃，明澈不雜。此類本處自是難得之物，每一兩大塊，真者人競珍之，市之不啻金價。古服食方亦或用之，必得此類，乃可入藥。其市肆所蓄，片如細屑，亦夾土石，入藥服之，為害不淺。誤中，解之用冷水研綠豆漿飲之。”砒霜主要成分為三氧化二砷 (ATO)，白色，八面體狀結晶，三氧化二砷加高熱可以升華，故精制比較容易，升華物普通名砒霜。上世紀70年代哈爾濱醫科大學創用“癌靈1號”(氧化砷注射液)治療APL患者，說明砷劑對某些髓系惡性增殖性疾病有確切的療效，含砷中藥對白血病的治療效果，再一次引起了國際腫瘤學界的關注[5]。ATO應用于臨床治療APL患者多年，現已被公認為是APL的標準治療方案[6]。最近幾年的研究表明，ATO具有廣泛的抑瘤作用，不僅可以抑制惡性血液腫瘤細胞增殖，對于肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌等其他腫瘤細胞同樣具有抑制作用[7-10]。

自2010年有學者發現ATO對Hh通路具有靶向性抑制作用以來，陸續有研究通過體內外實驗證實，ATO通過此種機制對包括骨肉瘤、間皮瘤、惡性橫紋肌樣瘤、惡性膠質瘤、胰腺癌、成神經管細胞瘤和尤文肉瘤甚至APL在內的多種腫瘤發揮殺傷作用，而且ATO的作用范圍不僅是腫瘤細胞，也包括部分腫瘤干細胞[11-15]。ATO對Hh信號轉導通路表現出特異性抑制，該抑制作用與ATO的細胞毒性、ATO對Ras和Wnt通路的抑制和對JNK和Pp38MAPK通路的活化起作用均無關[13]。

研究發現，ATO對Hh信號轉導通路的作用靶點為執行這條通路的核心蛋白Gli。ATO僅對Gli高表達腫瘤細胞具有較好的敏感性，而對Gli低表達的細胞株敏感性較差。目前推測ATO對Gli的作用機理為：Gli蛋白上存在與PML/RARα半胱氨酸殘基相同的巰基結構，因此ATO能夠與Gli蛋白結合并誘導其降解，體外研究已經發現，ATO長期作用能降解Gli2蛋白；并能與Gli1蛋白結合，抑制其靶基因Ptch和cyclinD1的表達[13-14]。此外，研究還發現，ATO短期作用還可以抑制Gli2在初級鞭毛的積累(該過程為Hh信號轉導通路的關鍵步驟)，這可能是與ATO對微管的直接作用相關。

研究采用不同濃度的ATO處理CML細胞K562發現ATO對Hh通路核心蛋白Gli2的抑制和誘導細胞凋亡均呈藥物劑量依賴性。但ATO的誘導凋亡效果落后于對Gli2抑制，ATO對Gli2的抑制作用開始于0.5 μM，該劑量對細胞的凋亡并未產生影響，當ATO濃度達到2 μM時，僅使少量CML細胞發生凋亡，但可使K562細胞的Gli2表達顯著受抑。因此ATO對Hh分子的抑制，并非是細胞凋亡的后果，表明ATO對Gli2的抑制具有靶向性。本研究在K562細胞上發現ATO對Gli2的抑制作用，與文獻報道的在其他細胞上ATO對Gli2的效果一致[13]。本研究還發現，ATO對K562細胞的Gli1蛋白并無抑制作用，該結果亦符合其他研究者的文獻報道[14]。Hh通路的負反饋調控因子Ptch低表達是CML患者預后不良的標志，Ptch是預測IM治療失敗的敏感和特異性指標[16]。本研究發現，在ATO作用后，Ptch2蛋白的表達有升高的趨勢，表明ATO可能是通過上調負調控因子的表達，抑制Hh通路。當ATO的濃度達到4 μM，大部分細胞死亡，Ptch2隨之降解。

總之，本研究證實，在CML細胞中，ATO對Hh通路具有顯著的抑制作用，主要是通過降解以Gli2為核心的蛋白發揮最用，并可一定程度上上調負調控因子Ptch2蛋白的表達。ATO對Hh通路的抑制作用具有特異性，發生在誘導凋亡之前。本實驗為擴大ATO應用于IM耐藥的CML提供了一個堅實的理論基礎。

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