MicroRNA-221基因在宮頸癌中的表達及臨床意義研究

王慧軍，李小蘭

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036）

宮頸癌是發(fā)病率僅次于乳腺癌的女性第二大惡性腫瘤，近年來，醫(yī)學(xué)技術(shù)的昌明發(fā)達，有效降低了宮頸癌的病死率，但由于人們生活方式的復(fù)雜多變，宮頸癌發(fā)病率仍呈居高不下的態(tài)勢，為進一步防治宮頸癌，提高人們生活質(zhì)量，從其他途徑對宮頸癌展開研究也十分重要。近年來臨床開始了關(guān)于宮頸癌與miRNA的研究，現(xiàn)有研究認為miRNA-145、145對宮頸細胞增殖有抑制作用，而miRNA-146對宮頸細胞增殖有促進作用，但尚缺乏其他miRNA基因與宮頸發(fā)生發(fā)展相關(guān)的研究。本文便以miRNA-221表達水平為研究方向，探討該基因在宮頸癌中的表達及臨床意義，現(xiàn)作如下報道。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集及臨床資料

選取2016年10月～2017年12月在本院接受手術(shù)切除治療的宮頸癌患者31例作為研究對象，平均年齡（42.8±5.56）歲，平均身高（157.4±5.31）cm，平均體重（53.2±6.81）kg，已排除了臨床資料不完整者。采取31例患者的宮頸癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本，組織標(biāo)本均置于1.5 mL的Eppendorf管中進行液氮保存。本次研究通過患者的知情同意，且標(biāo)本采集經(jīng)過我醫(yī)院的倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 細胞系及細胞培養(yǎng)

人宮頸癌細胞系：Hela和Siha細胞系均由我國中科院上海的細胞庫所提供，將Hela與Siha細胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清、1%的抗生素與1%的谷氨酰胺，然后將接種后的培養(yǎng)基置于保溫箱中進行培養(yǎng)。

1.3 RNA提取

R N A提取時，先將樣本組織由液氮中取出，以BioPluverizerTM冰凍粉碎法將組織粉碎，并加入l mL Trizol（Invitrogen）混勻，以MiniBead-Beater-16勻漿，然后進行MicroRNA的提取。分別將RNA進行洗滌、離心、干燥、溶水等操作后，取2 μL總 RNA于紫外分光光度計下進行MicroRNA純度測定，并對其含量予以計算。

1.4 cDNA獲取

按照反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTM RT reagent Kit（Takara，Japan）說明書所述，取1 μgRNA，加入反應(yīng)試劑，在普通PCR儀（BIO-RAD，USA）上完成反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。設(shè)置條件為：37℃60 min，95℃5 min。產(chǎn)物置于-40℃條件下保存。

1.5 實時熒光定量檢測

將多聚腺苷酸添加于其余的總RNA中，然后對其進行熒光PCR測定。根據(jù)熒光試劑SYBR. Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takara）說明書所述，使用LC480熒光定量PCR儀完成qRT-PCR反應(yīng)組織及細胞系中5’-TATCCAGACATGACTCCCACA-3’和5’-ACAGATCAGCCTGAACTTGc-3’。使用GAPDH作為內(nèi)參照，GADPH前向引物：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'；反向引物：5'-GAAGATGGTGGGATTTC-3'。設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃5 s，60℃15 s，70℃15 s，42個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用t/x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 在宮頸癌組織、宮頸癌細胞系（Hela和Siha）中表達

采用qRT-PCR檢測組織及細胞系中MicroRNA-221的表達水平，結(jié)果顯示MicroRNA-221在宮頸癌組織、宮頸癌組織系（Hela和Siha）中表達水平均高于癌旁組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 MicroRNA-221在細胞系中的相對表達量

2.2 宮頸癌標(biāo)本MicroRNA-221表達水平

所納入的31例病患中，有90.30%（28/31）的標(biāo)本中檢出MicroRNA-221表達水平，與正常組織相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。利用2-ΔCT對標(biāo)本中MicroRNA-221表達水平進行計算，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤為（0.574±0.0513）。

圖2 宮頸癌標(biāo)本MicroRNA-221表達水平

2.3 MicroRNA-221與宮頸癌臨床病理因素間的關(guān)系

MicroRNA-221與患者的年齡、腫瘤直徑、FIGO分期不存在相關(guān)性（P＞0.05），統(tǒng)計數(shù)據(jù)略）。而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率54.84%（17/31）明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性率3.33%（1/30），高或中分化癌組陽性率93.55%（29/31）也明顯高于低分化癌組陽性率51.61%（16/31），表示MicroRNA-221與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)（x2=0.04、0.01，P＜0.05）。

3 討 論

MicroRNA是最近十多年來發(fā)現(xiàn)的一種RNA分子，其長度約19～25 nt，存在于動植物體內(nèi)，在細胞中能夠起到時空特異性作用。現(xiàn)有資料指出，MicroRNA參與了人乳頭瘤病毒（HPV）的生命活動周期，而HPV感染又屬于宮頸癌發(fā)生的高危因素之一，因此認為MicroRNA與宮頸癌的發(fā)生存在相關(guān)性。目前來看，對于miRNA研究多集中在乳腺癌、腸癌、腦血管疾病、卵巢癌、血液系統(tǒng)疾病等方面，且以miRNA-221的研究為主。例如在常征等[1]報道了miRNA-221在前列腺癌中起表達上調(diào)，是一個促癌因子，張春智[2]研究報道發(fā)現(xiàn)敲低miRNA-221可以抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，王培松等[3]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌中的表達明顯增高。結(jié)合在其他腫瘤中的研究，發(fā)現(xiàn)miRNA-221在大部分腫瘤中扮演促癌因子的角色。而在宮頸癌中的研究較少，其與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系尚待研究進一步確認，因此本文就以宮頸癌患者為研究對象，觀察患者的表達水平以及與病理因素的相關(guān)性。

研究結(jié)果可見，宮頸癌患者的病理組織中均呈現(xiàn)出MicroRNA-221表達水平升高的現(xiàn)象，與正常組織相比差異十分明顯。再進一步觀察MicroRNA-221表達水平與宮頸癌臨床病理因素的相關(guān)性，納入病理因素指標(biāo)有患者年齡、腫瘤的直徑、FIGO分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。統(tǒng)計學(xué)比較可見，只有腫瘤的分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MicroRNA-221呈相關(guān)性，提示MicroRNA-221基因可能對宮頸癌發(fā)病發(fā)展起著影響作用。

當(dāng)然，本次研究也存在諸多的局限之處是需后期深入探究的，例如，本研究未能對不同腫瘤組織的MicroRNA-221表達水平差異性進行比較，因此無法獲知腫瘤類型不同是否會影響MicroRNA-221表達。再如，未能對MicroRNA-221功能類似物與抑制物對細胞的侵襲、增殖、凋亡等生物進程作進一步探究，無法明確其對宮頸癌的調(diào)節(jié)作用。后期應(yīng)該從如上兩方面展開更深一層研究，才能深入了解MicroRNA-221對腫瘤的調(diào)節(jié)，為宮頸癌等疾病的治療提供依據(jù)。

綜上所述，宮頸癌患者的病理組織中會顯示MicroRNA-221表達水平上調(diào)，這一特征對宮頸癌靶向治療方案的研究提供了新的途徑。

[1] 張春智.敲低miR-221和miR-222表達對膠質(zhì)瘤的抑制作用及機制的研究.In:天津醫(yī)科大學(xué),2009.

[2] 張春智,王廣舜,康春生,etal.敲低miR221/222上調(diào)PUMA促進膠質(zhì)母細胞瘤U251細胞凋亡的體內(nèi)研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2012,11(8).

[3] 王培松.MiR-221、222在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義.In:吉林大學(xué),2011.