刈割后黑麥草生理保護作用對其補償性生長的影響

郭安琪,周瑞蓮, 宋 玉, 馬會雷

魯東大學生命科學學院, 煙臺 264025

耐刈性是多年生牧草經受人工刈割脅迫后自身恢復保護的一種特性[1],也是人們可以定時刈割收獲牧草進行草地畜牧業生產和園林綠化建設的根本[2- 3]。因此,牧草的耐刈性在園林、草坪、畜牧業發展上起重要作用。

一些研究發現,牧草的耐刈性與刈割后牧草補償性生長有關[4- 5]。研究發現,適度刈割不僅可提高牧草葉片光能轉化率和光合速率(Pn)[6- 7],還可提高牧草種子產量和飼草產量[8- 9]。并認為,牧草的再生實質上是組織和器官的重建過程,刈割引發牧草碳同化能力增強形成的補償性光合作用可能是刈割后牧草生長加速的關鍵[5- 6,10]。目前國內對刈割的主要研究方向多集中在刈割強度、方式、時期以及施肥對牧草產量和品質的影響[5- 6,9,11]。對牧草而言,刈割行為是對葉片造成機械傷害,它可引發刈割部位的細胞液外滲和植物體水分平衡失衡。但牧草為何能在刈割脅迫傷害下還可進行補償光合作用和補償性,其適應刈割脅迫的生理調控機理目前尚不清楚。

關于牧草對逆境脅迫的適應機理研究較多。研究發現,在低溫[12]、干旱[13]、鹽[14]脅迫下,牧草葉片中抗氧化酶活力和丙二醛(MDA)含量增高。一些高寒山區的多年生牧草秋季冷適應過程中,根中抗氧化酶活力增加[15]。逆境條件下,牧草細胞中維持較高的抗氧化酶活力在抑制細胞膜脂過氧化、維護氧自由基代謝平衡和細胞膜的完整性上起重要作用。另外,研究還發現在干旱、低溫和鹽脅迫中牧草葉片中還積累滲透調節物(脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等),它們在提高細胞滲透壓和維護細胞持水力及水分代謝平衡上起作用[15- 16]。而且,逆境條件下牧草抗逆性與抗氧化酶活力和滲透調節物含量正相關。在干旱、寒冷、高溫、鹽脅迫下抗逆性強的植物可通過提高抗氧化酶防御體系活力和滲透調節能力提高抗逆性[13- 16]。然而,刈割脅迫后牧草在受傷害情況下的補償光合作用和補償性生長過程否與細胞具有較高的抗氧化能力有關;抗氧化酶是否參與了細胞抑制膜脂過氧化;刈割后葉片失水情況下滲透調節物是否參與了維護細胞的水分代謝平衡,關于這些問題目前尚不清楚。

黑麥草(LoliumperenneL)為普遍引種栽培的優良牧草。對該植物研究發現,刈割可明顯引發植株補償性生長[5,9,17- 18]。刈割后黑麥草殘茬中碳水化合物對再生起關鍵作用[19]。刈割可顯著提高其干草產量和蛋白質產量[9]。刈割后造成草地冠層光環境變化與黑麥草補償性生長密切相關,而且補償能力取決于刈割后剩余葉片的光合效率[5]。人們大多關注于刈割后殘存葉片中物質和能量轉化與葉片再生關系的研究,而對殘留葉片中抗逆生理變化研究較少。另外,研究結果通常是對整個殘存葉片的分析得來。由于黑麥草為禾本科植物在刈割放牧中通常是上部葉片被摘除,留下的下部葉片成為牧草恢復生長的關鍵部位,那么留下的葉片內發生了哪些生理變化維持著牧草的補償性生長呢？刈割部位和非刈割部位在抗逆生理調控上是否存在差異？而這一問題在大多數同類研究中較少涉及。

本研究以人工種植的黑麥草草坪綠化帶為試驗地,以黑麥草為實驗材料。在秋季氣溫涼爽適宜牧草生長的時間進行了刈割處理試驗。通過對牧草刈割處理生長的第6天和第12天黑麥草葉片不同部位抗氧化酶活力、膜脂過氧化產物、滲透調節物含量的分析以揭示刈割脅迫后葉片抗氧護酶活力和調節物含量變化與牧草補償性生長的關系,及在牧草補償性生長中的生理保護作用,進一步了解牧草耐刈性的生理調控機理。為牧草的抗逆育種和草地科學管理提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于煙臺市魯東大學校園內綠化帶上。煙臺位于119°34′—121°57′E, 36°16′—38°23′ N。屬于溫帶季風氣候,年平均降水量651.9 mm,主要集中在7—8月,占年降雨量的49%；年平均氣溫11.8 ℃,最熱月為8月(24.6 ℃),歷年極端最高氣溫38.4 ℃,土壤pH值為4.22—6.79。土壤為棕壤土。

1.2 試驗處理

魯東大學校園黑麥草綠化帶建植于2010年,在校園林工的管理下生長良好,處于營養生長階段。首先,在校綠化帶上選擇生長均勻、健壯、雜草少的黑麥草地塊為試驗地。然后將試驗地劃分為10塊用于5個處理：即對照、輕度刈割、中度刈割、重度刈割、全割,每一地塊約1.5 m ×1.5 m,每一處理重復2次,處理地塊按全部刈割、重度、中度、輕度、對照依次排列。黑麥草植株高度為30 cm,將植株葉片從頂部到底部劃分為4段：頂部(30—22 cm)、中上部(22—15 cm)、中下部(15—7 cm)、基部(7—0 cm)。在每一個處理地塊上,插5個35 cm長的竹棍,在竹棍高22 cm處、15 cm處、7 cm處、0 cm處(基部)分別用記號筆標記。輕度、中度、重度、全部刈割處理就是分別將植株頂部(在22 cm處)、中上部以上(在15 cm處)、中下部以上(7 cm處)、基部以上(0 cm處)剪除,不刈割為對照。同時各刈割處理中竹棍上的標記用于后期生長速率測量起始點。刈割后每兩天測定一次株高為生長速率。

1.3 試驗取材

為了能更詳細了解刈割傷害對黑麥草殘留葉片不同部位的影響,試驗分別對不同強度刈割后殘留葉片各段及再生葉進行了取樣和抗逆生理指標的測定。取樣是在刈割后第6天和第12天后的10:00進行。將植株頂部、中上部、中下部、基部各段分別記作①、②、③、④。取樣時首先將黑麥草葉片捋直,按竹棍上標記的刈割部位,首先將超過原定刈割高度部分剪下,記為再生葉片；接著將剩余部位(殘留葉片)分別按植株相應部位剪下各段。將剪下的葉片快速包裹放到液氮中固定,帶回實驗室保存在超低溫冰箱中,用于抗氧化酶活性、滲透調節物含量、丙二醛含量的測定。取樣是在同一刈割處理的兩個地塊上分別進行,重復兩次,各生理指標的測定重復5次以上。

1.4 試驗方法

生長速率采用測量法,在刈割后每兩天用量尺測定一次株高。

酶液提取是在4 ℃條件下進行的,準確稱取1 g液氮固定的葉片于預冷研缽中,加入酶提取液(pH值=7.8磷酸緩沖液),冰浴上研磨成勻漿,在15000 r/min 4 ℃條件下離心15 min,上清液用于抗氧化酶活力和脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白質和MDA含量的測定。

采用愈創木酚法測定POD活性[20]；采用氮藍四唑(NBT)光還原法測定SOD活性[21]；采用過氧化氫-碘量法測定CAT活性[22]。采用茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量;采用蒽酮法測定可溶性糖含量;采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質含量;采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.5 數據處理

實驗數據采用3個以上重復的平均值±標準差(mean±SD),用SPSS 11.5軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同強度刈割下黑麥草葉片生長速率比較

圖1 不同強度刈割后不同時間黑麥草葉片凈生長量比較 Fig.1 Comparison of net growth production of leaves of Lolium perenne L with different cutting intensities during growth

不同強度刈割后,經輕度和中度刈割的牧草生長速率較高,在12 d的生長中葉片凈生長量(株高)分別比對照增加了46.3% 和65.7%,但重度刈割卻降低牧草的生長速率(圖1)。然而,全割后牧草葉片生長量較對照增加了289%,生長速率遠高于輕度和中度刈割。結果表明,刈割后牧草表明出明顯的補償性生長。

2.2 不同強度刈割下黑麥草殘留葉片和再生葉片膜脂過氧化產物(MDA)比較

正常生長情況下,黑麥草葉片MDA含量在葉片上部較高,下部就較低,但差異不顯著(表1)。刈割處理6 d、12 d后,對照黑麥草葉片各部位丙二醛(MDA)含量變化不明顯。表中各刈割處理中各部位均表示刈割6 d和12 d后再生葉部分,也是刈割傷害部位。結果表明,不同程度刈割6 d和12 d后,刈割部位葉片在再生過程中葉內MDA含量均低于對照,并與對照差異顯著(P< 0.05)。與對照相比,不同強度刈割6 d和12 d,整個葉片平均MDA含量隨刈割強度的增加而降低,適度刈割下降9%,高強度刈割(重度、全刈割)分別下降31.8%、13.6%。刈割處理并未增加細胞內膜脂過氧化水平。該結果與何樹斌等對紫花苜蓿的研究結果一致[8]。

表1 不同強度刈割對黑麥草葉片MDA含量的影響/(μmol/g FW)

數字上的“*”表示再生部分,下同；同一時間不同刈割強度處理間不同字母表示差異顯著(P< 0.05);LC：輕度刈割, Light-cutting; MC：中度刈割,Moderate-cutting; SC：重度刈割,Severe-cutting; WC：全部刈割,Whole-cutting;FW: 干重

2.3 不同強度刈割下黑麥草殘留葉片和再生葉片抗氧化酶活力比較

對照葉片的SOD活力從葉片基部到頂端趨于增加,其中頂端SOD酶活力最高(表2)。與對照相比,不同強度刈割后6 d,除了輕度刈割,中部、重度、全部刈割后,整個葉片平均SOD活力趨于下降,其中重度刈割下降最多,較對照低27.0%。刈割后12 d,適度刈割(輕度和中度刈割)葉片平均SOD活力降低,但高強度刈割(重度和全割)葉片平均SOD酶活力高于對照,分別增高30.8%和8.5%。在刈割6 d再生葉中(各種刈割處理的各部位)SOD活力均低于對照相應部位,而處理12 d,再生葉SOD活力高于對照,尤其是中度、重度、全部刈割后再生葉中SOD活力分別較對照增高13.1%、54.9%、116.7%。結果表明,刈割后受刈割傷害部位SOD活力增加顯著。

對照黑麥草葉片POD活力從葉片基部到頂端逐漸下降,在葉片基部POD活力最大(表3)。與對照相比,各刈割處理葉片殘茬平均POD活力在刈割6 d,均有不同程度的上升。輕度、中度、重度、全部刈割6 d后,葉片平均POD活力分別較對照增高18.3%、24.5%、10.1%和30.9%。刈割12 d后,除了輕度刈割外,中度、重度刈割和全割葉片殘茬平均POD活力較對照的低。在刈割6 d后,輕度和中度刈割使頂部葉片再生部分POD活力增加,而重度和全割處理頂部葉片再生部分POD活力下降。刈割12 d后,不同強度刈割處理的葉片再生部分中POD活力均降低,如,中度、重度葉片再生部分和全割新生葉POD活力分別較對照下降25.6%、41.7%、40.1%。不同刈割處理后頂部葉片再生部分POD活力與對照相應部位差異顯著(P< 0.05)。

表2 不同強度刈割對黑麥草葉過氧化物歧化酶(SOD)活力的影響/(U FW-1 h-1)

表3 不同強度刈割對黑麥草葉片過氧化物酶(POD)活力的影響/(μgH2O2 g-1 FW min-1)

黑麥草CAT活力從葉片基部到頂端依次上升,葉片頂部CAT活力最高(表4)。與對照相比,刈割處理6 d黑麥草葉片平均CAT活力降低,中度、重度、全割處理分別降低13.6%、23.9%、23.9%。刈割處理12 d,不同刈割處理下葉片平均CAT活力小幅度增高,輕度、中度、重度、全刈割處理葉片平均CAT活力分別增加13.3%、15.7%、20.2%和23.4%。不同刈割處理中葉片頂部再生葉CAT活力均最高。刈割部位頂部再生葉片的酶活力變化與葉片平均酶活力變化相同。不同刈割處理6 d再生葉中CAT活力與對照相同,兩者差異不顯著(P>0.05)。處理12 d,不同刈割處理下再生葉葉片CAT活力均增高,輕度、中度、重度、全割葉片CAT活力分別增加6.8%、40.2%、39.8%和18.9%,并與對照差異顯著(P< 0.05)。

表4 不同強度刈割對黑麥草葉片過氧化氫酶(CAT)活力的影響/(μgH2O2 g-1 FW min-1)

2.4 不同強度刈割下黑麥草殘留葉片和再生葉片滲透調節物含量比較

黑麥草可溶性糖含量集中在葉片中部,在葉頂部和基部較低(表5)。刈割6 d與對照相比,黑麥草葉片平均可溶性糖含量隨著刈割強度增加而趨于下降,其中輕度、中度、重度、全部刈割處理葉片可溶性糖分別降低了22.2%、22.2%、57.1%、46.7%。刈割12 d后,不同刈割強度的黑麥草平均可溶性糖含量變化如刈割6 d,但下降幅度較6 d大。不同刈割強度下頂部再生葉中可溶性糖含量趨于下降,其中中度、重度、全部刈割處理6 d葉片可溶性糖含量分別下降30.8%、30.4%、25%；刈割12 d分別降低了16.7%、110.3%、43.5%、45.5%。不同強度刈割均使葉片可溶性糖含量下降,并與對照差異顯著(P< 0.05)。

表5 不同強度刈割對黑麥草葉片可溶性糖含量的影響/(μg/gFW)

黑麥草葉片脯氨酸含量集中在葉片中上部,下部含量較低(表6)。與對照相比,不同強度刈割6 d黑麥草葉片平均脯氨酸含量降低。輕度刈割降低較少,中度、重度、全部刈割葉片中脯氨酸分別降低10.1%、21.5%、14.5%。刈割12 d,經過一段時間的生長葉片中脯氨酸出現增長趨勢,其中中度、重度、全部刈割下葉片脯氨酸含量分別增加24.5%、23.5%和14.2%。不同強度刈割處理6 d,頂部再生葉中脯氨酸含量與對照相近,兩者差異不顯著。但處理12 d后,再生葉中脯氨酸含量增加明顯,中度、重度、全割處理下分別增高37.2%、29.6%、43.8%,并與對照差異顯著(P< 0.05)。

表6 不同強度刈割對黑麥草葉片脯氨酸含量的影響/(μg/g FW)

3 討論與結論

牧草耐刈性在畜牧業發展、園林建設中起重要作用。刈割促使牧草補償性生長是牧草持續生存、耐踐、耐刈、耐牧的關鍵。但目前尚不清楚維護刈割后牧草補償性生長的生理保護調控機理。

對不同刈割處理后葉片不同部位抗逆生理指標的測定結果表明,正常情況下沒有刈割的對照黑麥草葉片各部位抗氧化酶和滲透調節物含量不同(表1—6)。其中,葉片頂部膜脂過氧化程度較高,伴隨著較高的SOD、CAT活力和脯氨酸含量；與其相比,葉片中部MDA含量,SOD、CAT活力,及脯氨酸含量均降低；葉片基部,膜脂過氧化程度最低,與其相一致的是葉片SOD、CAT活力及脯氨酸含量也較低。在正常生長過程中,葉片各部位膜脂過氧化水平和抗氧化酶活力之間呈明顯正相關,并與其葉片各部位所處環境相關。黑麥草為直立條形葉片,其頂部光照強、氣溫高,導致葉片氣孔蒸騰作用強,水分丟失快。一方面缺水誘發氧自由基的積累引發膜脂過氧化,同時積累的氧自由基可激活抗氧化酶系統使抗氧化酶活力提高[13],另一方面缺水引發脯氨酸大量積累[23]。因此葉片頂部較高的抗氧化酶活力和較高的脯氨酸含量可有效地維護氧自由基代謝平衡和水分平衡,而在維持葉片頂部生存中起重要作用；與葉片頂部相比,葉片中部位于種群密度較高,光照較弱,氣溫低,葉片缺水程度較葉片頂部小,故而葉片中部處于較適宜的環境,葉片氧自由基產生和清除速率達到平衡[13,24],導致膜脂過氧化程度低、抗氧化酶活力也較低；而葉片基部位于種群底部,這里陰暗,潮濕,但由于葉片老化,光合和呼吸代謝強度弱,氧自由基積累少,故細胞膜脂過氧化程度小,MDA含量低,抗氧化酶活力低,脯氨酸積累少。

本研究發現,不同強度刈割下植株補償性生長速率不同。輕度和中度刈割的黑麥草補償性生長明顯,重度刈割表現不明顯,而全割處理補償性生長最明顯(圖1)。導致這一結果的原因可能是,輕度、中度、重度刈割是分別剪除了葉片的頂部、中上部、中下部部分。在刈割后牧草恢復生長中,輕度和中度刈割的牧草主要依賴于葉片中上部和中下部。而黑麥草葉片中部常處于種群相對適宜的環境,是生長較快的部位。因而在刈割后殘留葉片的中上部和中下部光合速率快速提高[25],生長速率增高而使輕度和中度刈割補償性生長明顯。而重度刈割后葉片的生長依賴于葉片基部的老葉,基部老葉光合作用和生命力均較弱[6],因而重度刈割后基部老葉光合作用積累的能量不足以彌補呼吸消耗,生長速率降低,使重度刈割在短時間內葉片無補償性生長。而全割處理清除了地上全部葉片,牧草再生只能依賴黑麥草莖基部、根頸和根系中的貯藏物質(如碳水化合物和含氮物質),這些物質在牧草再生啟動和初期生長中發揮重要作用[26- 27]。與其他刈割相比,全割處理為牧草的生長提供了開闊的空間、可流動的空氣、強的太陽輻射,這為新葉生長提供了有利用的環境條件。另外全割后地下根養分向上運輸距離短、速度快,加之地上沒有了基部老葉的呼吸消耗,使根中全部營養可用于新葉生長,這為新葉生長創造了物質條件。因此,全割引發黑麥草快速將根中養分向上運輸,促使新葉片生長和盡早恢復植株光合作用能力和能量輸入能力,因而新葉快速生長導致補償性生長明顯。但過度頻繁全割會導致根部營養輸出大于輸入甚至造成植物死亡。可見,刈割減少光合葉面積降低了能量合成能力導致植株能量代謝失衡是引發殘留葉片補償性生長的誘因,而殘留葉片補償性生長速率與其光合作用恢復速率密切相關[5- 6,10]。因此,在維護草地持續生長中輕度和中度刈割為適度刈割,頻繁全割將毀壞草地,不宜采用。

此外,本研究結果還表明,不同程度刈割短時間內(6 d)黑麥草葉片再生部分和葉片平均MDA含量,SOD和CAT活力,可溶性糖和脯氨酸含量均低于對照(表1—6),而不同程度刈割長時間內(12 d),黑麥草葉片再生部分和葉片平均MDA含量較對照低,但SOD和CAT活力增高,脯氨酸含量增加并高于對照。一方面不同程度刈割短時間內(6 d)和長時間內(12 d)黑麥草葉片再生部分和葉片平均MDA含量均較對照低。這表明,刈割后牧草補償生長與細胞維持較低膜脂過氧化水平有關。許多研究發現,在正常和脅迫條件下抗逆性強的野生甜菜[14]和耐鹽的無芒虎尾草[28]體內MDA含量明顯較低。沙漠環境生長的豬毛菜和差巴嘎蒿日間葉片MDA含量均較低[16]。生活在溫差較小、環境潮濕的地下根,其根中MDA含量也較低[29]。逆境條件下,細胞內MDA含量與植物存活和抗逆性呈負相關[30]。本研究表明,雖然刈割對黑麥草葉片造成了機械傷害,但刈割并未使受傷部位細胞膜脂過氧化程度加劇。細胞中較低的膜脂過氧化程度預示著細胞內氧自由基代謝趨于平衡有關[24,28]。因此刈割后細胞能維持氧自由基代謝平衡可能是其受傷部位快速自愈、整個葉片快速進行補償性生長的重要生理保障。另一方面研究表明,刈割后黑麥草殘留葉片低的膜脂過氧化水平與抗氧化保護酶活力和滲透調節物含量相關,抗氧化酶和滲透調節物與抑制膜脂過氧化及黑麥草補償性生長相關。其原因可能是,其一,刈割使植物光合作用葉面積迅速減少,導致葉片能量收支平衡失衡,可能快速刺激殘留葉片的快速生長以補償刈割造成的能量損失,從而啟動了植物的補償性生長[31- 32]。Belsky[33]認為補償性生長是植物受傷害之后的一種積極反應。其二,刈割引發黑麥草補償性生長依賴于植物光合作用生產的光合產物[10]。有研究發現,羊草[25]、黑麥草[34]、紫花苜蓿[8]在刈割后殘留葉片光合速率較沒有刈割的高,刈割后光環境的改善提高了葉片對光的轉化,使植物光合作用能力提高[34]。因此刈割后殘留葉片光合速率增加和植物光合補償能力的提高是植物補償生長的關鍵[6]。其三,由于光合和呼吸過程引發氧自由基積累[35],因此刈割后牧草葉片光合速率(Pn)的提高[6- 7],可引發細胞氧自由基積累。同時抗氧化酶是誘導酶[13],因而光合作用過程中積累的氧自由基又激活了抗氧化酶保護系統使SOD和CAT活力提高抑制膜脂過氧化。這可能是刈割12 d葉片MDA含量低,而SOD和CAT活力高的原因。抗氧化酶通過快速清除氧自由基,抑制氧自由基積累維護氧自由基代謝平衡而維護著殘留葉片的生長。例如,全割處理下,雖然根中儲備營養可為新葉生長提供物質基礎,但在新葉生長過程中葉中維持較高的SOD和CAT活力(表2,表4)和脯氨酸含量(表6),維持較低的MDA含量(表1)。新生葉較強的抗膜脂過氧化能力和保持水分的能力可能是黑麥草不懼全割的原因。由于生命是自由基產生與抗氧化作用間的平衡[36]。因此在刈割機械傷害下,殘留葉片快速提高抗氧化酶活力及時清除光合代謝中產生的氧自由基,使細胞中氧自由基產生和清除處于平衡狀態,這在黑麥草刈割后殘留葉片快速進行補償性生長中起重要生理保護作用。其四,刈割使葉片產生傷口,導致葉片水分丟失,缺水可能引發殘留葉片脯氨酸含量增加[16]。其脯氨酸親水性極強,能穩定原生質膠體及組織內的代謝過程,有防止細胞脫水的作用,而在殘茬葉片快速補償性生長中是重要的水分穩定劑[23]。研究表明,雖然不同強度刈割下葉片補償性生長速率不同,但不同強度刈割均可激活殘留葉片抗氧化保護酶系統和促進滲透調節物的積累。在補償生長過程中,CAT和SOD能及時清除殘留葉片中積累的氧自由基,抑制膜脂過氧化、維護氧自由基代謝平衡,積累的脯氨酸能維護細胞水分平衡,而使它們在黑麥草補償生長中起重要生理保護作用。

綜上所述,不同強度刈割后黑麥草葉片補償性生長速率差異顯著,輕度和中度刈割后殘留葉片為生活力強的葉片中部,葉片補償性生長明顯,重度刈割后殘留葉片為生活力弱的基部老葉,葉片補償性生長不明顯。因此,刈割減少光合葉面積降低能量收入導致植株能量失衡是引發補償性生長的誘因,而補償性生長的速率與殘留葉片生活力成正相關。然而,不同強度刈割后,殘留葉片SOD和CAT活力及脯氨酸含量增高,而MDA含量一直維持較低水平。可見,不同強度刈割均可激活殘留葉片抗氧化保護酶系統和促進滲透調節物的積累。在補償生長過程中,CAT和SOD能及時清除殘留葉片積累的氧自由基,抑制膜脂過氧化、維護氧自由基代謝平衡、保護細胞膜完整性,積累的脯氨酸能維護細胞水分平衡。因而抗氧化酶和滲透調節物在黑麥草刈割后維護細胞較低的膜脂過氧化水平和其快速補償生長中起重要生理保護作用。

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