不同樹葉凋落物對人參土壤理化性質及微生物群落結構的影響

孫 海,王秋霞,張春閣,李 樂,劉政波,劉 寧,邵 財,張亞玉,*,嚴 珺,李躍雄

1 中國農業科學院特產研究所, 長春 130112 2 上海上藥神象健康藥業有限公司, 上海 200336

人參(PanaxginsengC.A. meyer)為五加科多年生草本植物,是大宗名貴中藥材。目前主要有農田栽培和林下護育兩種生產模式,而林下護育人參是一種仿野生護育的高品質人參,具有人為干擾少、生長周期長的特點使其生長若干年后具備一定的野山參外部形態和內在品質特征,2015版藥典正式將林下護育人參定義為“林下山參”。研究發現林下山參存苗率、紅皮病發病率、根的形態建成及品質形成與其生長的森林生態環境條件密不可分[1- 4]。

土壤特性、伴生樹種、海拔高度、坡度等多個因素影響人參皂苷積累和參根形態結構建成。土壤特性直接影響人參生長發育,而伴生樹種是影響土壤的重要因素,這是因為(1)：樹種凋落物是森林土壤有機質和養分的主要補給途徑,同時也是植物——土壤間碳氮循環的重要途徑[5- 6]；凋落物作為土壤有機質地上部分的主要來源,其輸入的數量和質量變化可能改變土壤中碳的積累或流失狀況,不同生產模式下人參土壤肥力研究表明野山參土壤有機質含量是農田栽參土壤的10倍以上[7- 9],且在大多數生態系統內,由土壤供給植物所需要的養分中超過90%的氮和磷以及超過60%的其他礦質元素均來自于凋落物的分解[10]。(2)不同的樹種凋落物中含有不同的碳源和氮源,驅使土壤微生物集群定向進化,進而改變土壤肥力[11]。如北方針葉林森林生態系統,土壤礦化層和凋落物重含有大量不易被微生物利用的木質素和腐殖酸,由于碳源的影響,土壤微生物集群以分解復雜結構有機碳為主[12]。另外,不同凋落物土壤pH值和C/N是影響微生物集群定向進化的重要因素[13]。許多研究已經證實樹種凋落物對于增加土壤中微生物量碳氮、提高土壤養分、改變土壤微環境具有重要意義[14-15]。

大量研究表明樹種凋落物影響土壤養分釋放、生物地球化學過程以及微生物生態組成[16-17]。土壤微生物群落是陸地生態系統的重要生物成分,其結構和功能多樣性與土壤功能關系密切,在土壤生態系統中扮演重要角色,如氮循環、有機質礦質化、土壤有機碳的保存和釋放,以及對環境擾動的響應[18-20]。特定的土壤微生物群落結構對于穩定土壤結構和維持土壤生態功能至關重要[21],鑒于土壤微生物對于土壤生態系統物質循環的重要性,目前農田栽參連作障礙、林下山參土壤抗逆境脅迫能力以及林下山參根形態建成等方面研究均聚焦在土壤微生物多樣性[22-23]。利用磷脂脂肪酸方法研究發現林下山參土壤中微生物生物量(670.64 nmol/g)遠遠大于農田栽參土壤(266.80 nmol/g),其中林下山參土壤中有益微生物菌群(放線菌)含量是農田栽參的3.86倍；同時在林下山參土壤中發現代表抗逆性微生物藍細菌(18:2ω6),而農田栽參土壤未檢出[24]。由此可見,林下山參能夠健康在同一地點生長十幾年甚至幾十年不感病與其土壤微生物群落結構密切相關。

人參品質形成受其生長的土壤環境影響,而林下山參品質優劣往往與其護育的森林生態環境密切相關。選林是林下山參護育第一步,也是林下山參護育成敗所在。為了進一步研究不同樹葉凋落物對土壤性質及微生物群落結構組成的影響,本研究以添加不同樹葉凋落物人參土壤為研究對象,利用16S 和ITS測序技術研究不同土壤凋落物對人參土壤養分、微生物群落結構組成的影響,旨在為林下山參護育選擇林地和農田栽參土壤改良提供理論科學依據和理論指導。

1 材料與方法

1.1 盆栽土壤和樹葉的收集

盆栽土壤和樹葉收集地點選在林下山參主產區吉林省撫松縣楞場村吳杰林下山參護育基地(127°75′78″E, 42°81′12″N),收集時間為2014年10月。盆栽土壤取至基地旁邊廢棄3 a的農田土,收集20 cm深土壤并過0.9 mm篩備用,供試土壤pH 5.89,有機碳為20.89 g/kg,堿解氮161.32 mg/kg,有效磷25.83 mg/kg,速效鉀為220.54 mg/kg。同時在林下山參基地收集色木槭、赤松、胡桃楸、紫椴和蒙古櫟的落葉,收集到的樹葉在35 ℃下烘至恒重并過0.01 mm篩備用,不同樹葉凋落物的各元素含量見表1。

表1 供試樹葉凋落物各元素含量

色木槭Acermono. Maxim. var. mono;赤松PinusdensifloraSieb. et Zucc;胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim;紫椴TiliaamurensisRupr.; 蒙古櫟QuercusmongolicaFisch. ex Ledeb

1.2 實驗設計及土壤樣品準備

盆栽試驗按照6個處理3次重復,采用完全隨機區組方法設計,實驗于2013年10月布置在中國農業科學院特產研究所。樹葉添加量按照張新平[25]調查方法,連續3 a調查吳杰林下山參基地單位面積落葉量,最終確定盆栽土壤樹葉加入量為5.0 g/3.5 kg(樹葉/干土),本試驗6個處理分別為：A：色木槭Acermono. Maxim. var. mono(5.0 g)、B：赤松PinusdensifloraSieb. et Zucc.(5.0 g)、C：胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim.(5.0 g)、D:紫椴TiliaamurensisRupr.(5.0 g)、E：蒙古櫟QuercusmongolicaFisch. ex Ledeb.(5.0 g)、F：對照(不添加樹葉凋落物),其中色木槭、胡桃楸、紫椴和蒙古櫟為闊葉林樹種,赤松為針葉林樹種。不同樹葉凋落物風干后,粉碎過60目篩后與土壤充分混勻作為供試土壤,挑選大小一致的3 a生人參苗5株種植在黑色的PVC營養缽里(直徑為120 mm,高度為180 mm),每個營養缽作為一個重復。盆栽溫度在17—28 ℃之間,相對濕度在70%—80%之間,所有的處理每周澆一次水,每次每盆1 L水。

2014年3月盆栽人參一個生育期結束,收集每株人參根區20 g土壤,并將每盆中5株人參根區土壤混合作為一個重復。所有處理土壤樣品過2.0 mm篩,一部分自然風干用作土壤理化分析,另一部分轉移至-80 °C冰箱中用作DNA提取。

1.3 測定指標及方法

土壤pH值按照土水比1∶2.5比例,采用梅特勒SK 220 pH計測定,土壤有機碳、全氮利用德國產元素分析Vario EL Ⅲ測定[26],堿解氮采用培養皿擴散法測定,速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色測定,有效鉀采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定,具體測定方法參見土壤農化分析[27]；土壤微生物碳和氮利用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法[28],利用總有機碳分析儀(Vario TOC,德國)測定提取液中有機碳含量,用連續流動分析儀(AA3,德國) 測定總氮含量。測定結果分別乘以校正系數KEC 0.45和KEN 0.54,即為土壤中微生物量碳氮含量。

1.4 DNA提取和擴增

DNA提取：準確稱取0.1 g土樣,按照MoBio強力土壤微生物DNA提取試劑盒(Power SoilTM DNA IslationKit, MoBio, USA)說明書步驟,分別提取不同樹葉處理的3個重復土樣總DNA。經1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA完整性、Mini Dorp測定DNA純度和濃度。提取的DNA于-20 ℃保存、備用。

擴增：細菌和真菌核糖體編碼基因相應區段的擴增及測序服務由諾禾致源生物信息公司完成。細菌多樣性的測定參考Caporaso等[29]的方法,擴增細菌16S rDNA V4區段,引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。真菌多樣性采用ITS1區段進行測序分析。引物為ITS5- 1737F (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)。DNA擴增條件為98 ℃預變性1 min,98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,30個循環,72 ℃延伸5 min。測序采用Illumina MiSeq平臺。

1.5 數據統計和分析

所測得原始序列截去Barcode序列和引物序列后,經FLASH拼接獲得原始 Tags數據。原始Tags經QIIME過濾處理獲得高質量Tags 數據(CleanTags),并與數據庫進行比對檢測嵌合體序列,最終獲得有效數據(Effective Tags)。以97%相似性為依據,利用UPARSE pipeline軟件(V7.0.1001)將各序列聚類成為OTUs。為獲得土壤樣品中微生物物種的多樣性信息,使用cluster軟件對所得序列進行聚類,并利用RDP classifier(V2.2)軟件與數據庫進行物種注釋,統計每個樣品在各分類水平上的構成。

相關性分析采用SAS 9.0軟件處理,圖片利用Excel 2013和CANOCO 5.0制作。

2 結果與分析

2.1 土壤性質

不同樹葉處理的3年生人參經過一個生育期后,土壤基礎理化性質如表2。添加樹葉處理的土壤(處理A、B、C、D和E)pH值均高于對照(F)土壤pH值5.91(P<0.05)。不同處理下土壤容重由對照0.96 g/cm3分別降低至處理A 0.90 g/cm3、處理C 0.95 g/cm3、處理D 0.94 g/cm3及處理E 0.95 g/cm3。添加不同樹葉后土壤有機碳和全氮含量變化范圍分別為20.20—28.90 g/kg和2.20—4.11 g/kg。不同樹葉處理C/N顯著低于對照(P<0.05),而微生物量碳氮、速效氮磷含量顯著增加,其中處理A、B和C土壤微生物量碳含量高于處理D、E,處理E中微生物量氮含量最高,處理A、D、C、B中微生物量氮含量依次降低,但均顯著高于對照(F)(P<0.05)。

表2 土壤基礎理化性質

色木槭Acermono. Maxim. var. mono;赤松PinusdensifloraSieb. et Zucc;胡桃楸JuglansmandshuricaMaxim;紫椴TiliaamurensisRupr.; 蒙古櫟QuercusmongolicaFisch. ex Ledeb; F：對照; 表中數值為平均值± 標準誤 (n=3),同一行不同小寫字母表示不同處理在0.05水平下達到顯著差異水平

2.2 測序數據的基本分析

以不同樹葉處理的18個人參土壤樣品為研究對象,16S rDNA測序得到1478922個reads,而ITS1測序得到1250222個reads。以97%相似性為依據,過濾處理獲得高質量序列,其中16S rDNA分析共得到1367082條序列,單個土壤樣品中變化范圍為從29572條至236044條,而ITS1分析中共得到761544條序列,單個土壤樣品變化范圍從22725條至129253條,以上序列被保留用作進一步分析。所有樣品16S rDNA測序一共得到6064個 OTUs,不同樣品OTU數目變化范圍為2890至4750,ITS1測序一共得到1990個OTUs,不同樣品OTU數目變化范圍為480至1370。

在16S rDNA所有序列中,其中27342條(2%)為沒有分類的序列,其余的序列在門的水平上由大到小依次為Protecbacteria(41%)、Acidobacteria(18%)、Actinobacteria(14%)、Gemmatimonadetes(8%)、Chloroflexi(5%)、Crenarchaeota(3%)、Nitrospirae(3%)、Firmicutes(2%)、Verrucomicrobia(2%)及Bacteroidetes(2%)(圖1a)。在綱的水平共鑒定117綱,大于1%的序列共19個,從大到小依次為Alphaproteobacteria(18.07%,13.99%—21.03%)、Acidobacteria- 6(18.07%,9.53%—12.35%)、Betaproteobacteria(9.11%,8.56%—9.49%)、Deltaproteobacteria(7.69%,7.11%—7.99)、Actinobacteria(6.72%,6.58%—7.66%)、Gammaproteobacteria(5.90%,5.38%—6.48%)、Gemmatimonadetes(4.68%,4.21%—5.51%)、Acidimicrobiia(3.23%,2.94%—3.57%)、Chloracidobacteria(2.97%,2.71%—3.36%)、Thaumarchaeota(2.88%,2.25%—3.73%)、Gemm- 1(2.79%,2.57%—3.15%)、Nitrospira(2.65%,2.33%—2.85%)、Thermoleophilia(2.31%,2.00%—2.59%)、Ellin6529(2.15%,1.97%—2.29%)、Sphingobacteriia(2.06%,1.76%—2.34%)、Solibacteres(2.01%,1.72%—2.19%)、Bacilli(1.42%,0.61%—2.13%)、[Spartobacteria] (1.26%,0.94%—1.61%)和MB-A2- 108(1.10%,0.91%—1.22%)。在目的水平上,共鑒定170目,大于1%的序列共20個。在科水平上,共鑒定213科,大于1%的序列共17個。在屬水平上,共鑒定225屬,大于1%的序列共5個。

而ITS1所有序列中,7615條(10%)為沒有被分類的序列,其余的序列在門的水平上以Ascomycota所占比例最大為60%,依次分別為Basidiomycota(24%)、Chytridiomycota(5%)和Zygomycota(1%)(圖1b)。在綱的水平共鑒定98綱,大于1%的序列共11個,從大到小依次為Sordariomycetes(30.81%,21.77%—45.86%)、Agaricomycetes(23.78%,9.58%—42.72%)、Eurotiomycetes(11.83%,6.02%—21.49%)、Dothideomycetes(3.99%,2.50%—5.23%)、Chytridiomycetes(3.08%,0.12%—16.42%)、IS-s-Chalara sp(2.63%,0.04%—10.30%)、Leotiomycetes(2.12%,0.84%—4.64%)、Un-s-Ascomycota sp(1.82%,0.75%—3.29%)、Pezizomycetes(1.60%,0.06%—5.13%)、Un-s-Chytridiomycota sp(1.47%,0.30%—4.21%)和Un-s-fungal endophyte(1.16%,0.13%—5.71%)。在目的水平上,共鑒定196目,大于1%的序列共19個。在科水平上,共鑒定330科,大于1%的序列共19個。在屬水平上,共鑒定435屬,大于1%的序列共22個。

圖1 16S rDNA (a)和ITS1 reads(b)總體分類統計圖Fig.1 Overall taxonomic sequence analysis for all bacterial 16S reads(a) and fungal ITS1 reads(b)

圖2 不同樹葉處理下人參土壤細菌、真菌的聚類分析圖 Fig.2 Weighted Unifrac UPGMA cluster of bacterial and fungal communities associated with different soil samples from different leaf-added treatments. The figure was constructed on the basis of Illumina sequencing data

利用聚類分析對不同樹葉處理下人參土壤細菌和真菌群落結構的相似性分析結果(圖2)。如圖所示人參細菌群落可以被聚成四組：第一組包括處理E和處理F,第二組包括處理A和處理C,第三組包括處理D,第四組包括處理B。真菌群落同樣可以被分成四組：第一組包括處理B和處理F,第二組包括處理C和處理D,第三組包括處理A；第四組包括處理E。主坐標分析進一步揭示土壤微生物群落結構組成與添加不同樹葉有關。

在門的水平上,所有樹葉凋落物處理人參土壤細菌優勢菌群前五位相同(圖3),依次為Proteobacteria(35.38%—43.698%)、Acidobacteria(17.10%—20.34%)、Actinobacteria(12.77%—14.76%)、Gemmatimonadetes(7.85%—9.36%)、Chloroflexi(4.37%—5.02%)。但是細菌Firmicutes、Crenarchaeota、Verrucomicrobia、Nitrospirae、Bacteroidetes在不同樹葉處理土壤中地位不同。在門的水平上,人參土壤真菌優勢菌群均為Ascomycota,添加樹葉處理土壤中真菌Basidimoycota豐度為第二位,而對照土壤中真菌Chytridiomycota為第二位(圖3)。

圖3 不同樹葉處理土壤細菌、真菌在門水平上系統分類圖Fig.3 Taxonomic classification of bacterial and fungal reads of soil samples with different leaf addition treatments at the phylum level, using RDP classifier

為了明確不同樹葉處理對土壤微生物的地位的影響,利用SAS 9.0軟件進行方差分析,結果表明細菌Bacteroidetes在闊葉林樹種土壤中豐度顯著高于針葉林,而Proteobacteria在添加樹葉處理中顯著高于對照土壤(P<0.05),可能與樹葉在土壤中分解轉化有關。不同樹葉處理下,真菌Ascomycota的豐度赤松樹葉處理與對照之間存在極顯著差異,而樹葉處理B土壤真菌Basidiomycota的豐度極顯著低于處理C、處理D和處理E(P<0.01)(圖4)。不同樹葉處理下土壤細菌Proteobacteria和Bacteroidetes及真菌Ascomycota和Basidiomycota多樣性不同,可能是響應特定樹葉分解的功能微生物,如Bacteroidete和Ascomycota適宜在高微生物量氮(126.48—145.90 mg/kg)、全氮(2.66—4.11 mg/kg)及有效磷(29.33—52.80 mg/kg)土壤條件下生存,而Ascomycota適宜在低有效鉀(128.67—206.86 mg/kg)條件下生存。

圖4 不同處理下土壤主要細菌和真菌豐度差異性Fig.4 Dominant bacterial and fungal relative abundance of phylogenetic genera in different treatments圖中小寫字母表示在0.05水平下呈顯著差異水平,**表示在0.01水平下呈極顯著差異水平

利用LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)在不同處理間不同分類水平進一步尋找具有統計學差異的Biomarker(圖5)。色木槭樹葉凋落物土壤標志性細菌種群為根瘤菌目(Rhizobiales),標志性真菌種群為炭疽菌Colletotrichum_anthrisci。赤松樹葉凋落物土壤標志性真菌包括兩個屬和兩個種,兩個屬分別為Chalara和Xenopolyscytalum,兩個種分別為Exophiala_equina和Podospora_glutinans。胡桃楸樹葉凋落物土壤標志性細菌為紅螺菌目Rhodospirillales。紫椴標志性細菌為鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas,標志性真菌為Harzia_acremonioides。蒙古櫟樹葉凋落物土壤標志性真菌共有1個科和4個屬,一個科為盤菌科Pezizaceae,4個屬分別為Trichoderma、Pilidiella、Minimedusa和Talaromyces。

圖5 LEfSe分析進化分枝圖Fig.5 Cladogram of soil bacterial and fungal in different treatments via LEfSe method identifies the significantly different abundant taxa(LDA score=4.0)進化分支圖由內至外輻射的圓圈代表了由門至種的分類級別；在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類,小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比；著色原則為將無顯著差異的物種統一著色為黃色,其他差異物種按該物種所在豐度最高的分組進行著色

2.3 土壤性質與微生物多樣性的相關性

枯枝落葉是土壤中碳氮主要來源,但是不同樹葉對土壤中理化性質及微生物群落結構影響不同,特別是土壤微生物量碳氮、全氮及速效氮磷鉀(表2)。為了揭示土壤理化因子對微生物群落結構的影響,利用CANOCO 5.0對土壤因子pH(pH值)、SOC(土壤有機碳)、TN(全氮)、C/N(碳氮比)、AN(速效氮)、AP(速效磷)、AK(速效鉀)、SMBC(微生物量碳)和SMBN(微生物量氮)與細菌(Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Firmicutes、Crenarchaeota、Chloroflexi、Verrucomicrobia、Nitrospirae和Bacteroidetes)及真菌(Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota和Zygomycota)開展冗余分析(圖6)。結果表明SMBN、TN、AP、SOC、AK、C/N、pH值與細菌Bacteroidetes、Chloroflexi、Actinobacteria及真菌Basidiomycota、Zygomycota、Chytridiomycota及Ascomycota相關,受添加樹葉種類影響。不同樹葉處理土壤包含不同的微生物群落結構組成,功能微生物通過地位改變響應不同樹葉處理,可能與土壤理化性質有關,特別是土壤中SMBN、TN、AP、SOC、AK、C/N、pH值有關,Chu等人在中國北方森林土壤微生物中研究發現微生物地位改變與微生物碳氮密切相關,盡管其他環境因子也可能與微生物群落結構組成有關[30]。

分析Axis1的特征值為0.7928,解釋度為83.24%,Axis2的特征值為0.0959,解釋度為10.07%,Axis1和Axis2對整體的解釋度為93.31%,且前四個Axis解釋度達到99.04,P值為0.046。

3 討論

3.1 不同樹葉處理對土壤理化性質的影響

土壤pH是人參選地的一個關鍵性指標[16],而土壤容重直接影響人參根的形態建成[31]。添加不同樹葉處理后土壤容重降低、pH提高(表2)。之前研究表明人參生長適宜的條件為容重小于1 g/cm3、微酸性且具有高的養分供應能力[32]。人參連作土壤呈現pH值降低、養分含量下降、土壤微生物群落結構紊亂[33],本研究中添加不同樹葉處理后土壤pH及容重改變可能有助于提高人參生長過程抵抗環境脅迫能力。

添加不同樹葉處理后人參土壤有機碳、全氮、速效氮磷含量均增加,但是不同樹葉處理增加程度不同。在森林生態系統中,落葉分解是促進養分循環的一個重要途徑,樹種和落葉量直接影響土壤養分含量[34-35]。枯枝落葉被視為土壤有機碳主要來源且影響著有機碳的礦化率,添加樹葉后土壤有機碳、全氮及速效氮磷含量有不同程度增加,特別是添加胡桃楸、紫椴和蒙古櫟樹葉的3個處理土壤有機碳增加幅度最大,進一步證實落葉能夠提高土壤養分含量[36-37]。其機理可能是樹葉通過微生物分解在地球化學循環中產生巨大的碳流,將樹葉中養分歸還到土壤中,使其有助于植物生長[38]。除此之外,微生物自身繁衍受到碳源和養分的限制,進而影響樹葉分解過程。

圖6 不同處理下人參土壤微生物與土壤因子冗余分析 Fig.6 Redundancy analysis(RDA) based on the relative abundance of miacrobial phyla and select soil properties in adding leaf litter treatmen變形菌門,Proteobacteria；酸桿菌門,Acidobacteria；放線菌門,Actinobacteria；芽單胞菌門,Gemmatimonadetes；厚壁菌門,Firmicutes；泉古菌門,Crenarchaeota；綠彎菌門,Chloroflexi；疣微菌門,Verrucomicrobia；硝化螺旋菌門,Nitrospirae；擬桿菌門,Bacteroidetes；子囊菌門,Ascomycota；擔子菌門,Basidiomycota；壺菌門,Chytridiomycota；接合菌門,Zygomycota

添加不同樹葉后土壤中微生物量碳氮含量增加,但增加程度不同,其中色木槭對土壤微生物量碳氮增加效果最明顯,這與前人在森林土壤中研究微生物量碳氮一致[5,39]。原因可能是添加樹葉后為土壤微生物提供了更多種類的碳源,促進微生物的繁衍[40]。土壤C/N被視為土壤質量變化的指示因子,其大小能夠反映養分利用效率、同時與碳氮循環及養分植物有效性有關[41],Hawke和Vallance[40]已經證實在土壤微生物參與有機質分解過程中低C/N促進養分的釋放,本研究中添加樹葉后土壤中C/N均低于8(對照8.36),而有機碳和土壤速效氮磷含量較高。進一步說明C/N能夠調節土壤微生物繁衍和養分釋放之間的平衡。

3.2 不同樹葉處理對土壤微生物群落結構組成的影響

添加不同樹葉處理人參土壤微生物群落結構發生改變,功能微生物地位發生改變。人參土壤細菌和真菌群落組成受針葉林和闊葉林分類影響較大,闊葉林之間微生物群落結構組成相近(圖2)。其原因可能是闊葉林樹葉分解引入土壤中碳含量比針葉林高,且闊葉林中包含更為豐富的碳源種類,導致了闊葉林下土壤微生物多樣性高于針葉林[42]。而針葉林微生物群落組成相對單一,且針葉林土壤中含有大量的不易被微生物利用的木質素和腐殖酸,分解過程中主要以分解復雜結構有機碳為主的微生物(K-strategists)主導[12],由于碳源的種類及含量導致了不同樹種微生物集群的改變。

不同樹葉處理后人參土壤優勢微生物種類相同,但是功能微生物地位發生改變。選擇適宜樹種是林下參護育成敗的關鍵,盡管樹葉凋落物對土壤微生物影響的研究較多[43-44],但是林下參土壤微生物結構和功能響應樹葉凋落物分解的研究尚屬空白。樹葉的分解是影響土壤養分組成和微生物群落結構的重要因素,而不同的土壤特性可以誘導土壤微生物集群的改變[45],本研究中土壤細菌Proteobacteria是所有樹葉處理中的優勢菌群,被視為樹葉分解轉化的主要功能細菌,該研究結果與先前研究結果相一致[46-47]。除此之外,細菌Bacteroidetes在闊葉林處理下豐度顯著高于針葉林(圖4),而細菌Bacteroidetes已被證實是闊葉林分解的關鍵細菌[48],這有助于進一步評價闊葉林和針葉林對土壤理化性質的影響。添加樹葉后真菌Basidimoycota和Chytridiomycota地位同樣發生改變,與不同樹葉所含的有機碳結構復雜程度不同,同時真菌自身繁衍對環境碳源和氮源的選擇性,導致真菌地位的改變,比如真菌Ascomycota多樣性高于對照, Basidiomycota多樣性在赤松樹葉處理土壤中高于胡桃楸、紫椴和蒙古櫟處理的土壤。

土壤細菌的不同分類水平上,在紫椴樹葉凋落物處理土壤中鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas在目、科水平下特異表達，鞘氨醇單胞菌屬可能是紫椴樹葉處理的特異細菌。鞘氨醇單胞菌屬已被證實能夠分泌過氧化氫酶、提高植物抗逆性,被視為植物益生菌[49],該細菌屬可能與林下參高抗逆性有關。不同樹葉處理下土壤真菌在不同分類水平上特異表達。炭疽菌Colletotrichum_anthrisci為色木槭凋落物特異土壤真菌[50],疽菌是引起人參炭疽病的主要致病菌,需要警惕。赤松凋落物土壤真菌包括兩個屬(Chalara和Xenopolyscytalum)和兩個種(Exophiala_equina和Podospora_glutinans),目前相關功能并不清楚,可能與針葉林分解有關。Harzia_acremonioides為紫椴樹葉凋落物特異真菌。在屬水平上,Trichoderma、Pilidiella、Minimedusa和Talaromyces為蒙古櫟土壤特異真菌,該菌屬可能參與凋落物的分解。

4 結論

土壤理化性質和土壤微生物群落結構組成受不同樹葉添加物影響,盡管不同樹葉添加后對優勢微生物種群改變不大,但是功能微生物地位發生改變。添加不同樹葉后提高了土壤中微生物量碳氮含量、增加土壤速效氮磷含量,同時改變土壤pH值和容重；18個土壤樣品基因組,經16S和ITS測序分別得到6064和1900個OUTs。其中細菌涵蓋了42門、117綱、170目、213科、225屬,真菌涵蓋了24門、98綱、196目、330科、435屬。細菌Proteobacteria是樹葉分解的關鍵微生物。而細菌Bacteroidetes和真菌Basidiomycota可能是區別闊葉林和針葉林樹種的關鍵微生物,真菌Ascomycota是針葉林分解的功能微生物。從不同分類水平上得到特定樹葉凋落物的特異細菌和真菌,不同樹葉處理下人參土壤功能微生物的位置及多樣性的改變均與土壤因子有關。通過進一步分析不同樹葉對土壤理化性質及微生物群落結構組成的影響,將有助于模擬森林土壤微生物分布、繁衍及多樣性,對于林下參選地和農田栽參土壤微生物改良具有實踐意義。

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