黃土丘陵區不同施肥處理對土壤微生物特性的影響

梁楚濤,張嬌陽,艾澤民,肖 列,薛 萐1,,*

1 中國科學院教育部水土保持與生態環境研究中心黃土高原土壤侵蝕與旱地農業國家重點實驗室,楊凌 712100 2 中國科學院大學,北京 100085 3 西北農林科技大學水土保持研究所,楊凌 712100

黃土高原土壤貧瘠,已成為該區作物產量提高的一個重要限制因素[1]。而隨著人口的快速增加,特別是退耕還林政策的實施,該區域面臨著嚴重的糧食供應問題,截至2008年,黃土高原地區已退耕土地483萬hm2,局部已出現人-糧關系緊張的局面[2]。施肥由于可明顯地改善土壤理化性質、增加土壤肥力,調節土壤養分循環,提高作物產量[3-4],越來越受到人們的重視。但由于肥料種類的不同,長期施肥對土壤質量的影響也存在較大差異,如一些研究發現長期使用無機肥會導致土壤質量下降,農業污染加重[4-5]。如何合理培肥,保持糧食產量、土壤質量和環境之間的友好發展已成為研究的重點。

土壤微生物群落被認為是土壤生態系統變化的預警及敏感指標,用來指示土壤質量變化。施用的肥料可以通過影響土壤化學成分引起土壤微生物活性、土壤微生物群落結構改變,也可以通過改變土壤的物理性狀影響地上植被的生長狀況,從而間接地影響土壤微生物群落結構[4]。有研究表明施肥管理可以迅速地影響土壤呼吸、微生物量及其他土壤性質[6]。近年來,許多學者也開展了不同地區長期施肥對微生物量碳氮[6-7]、微生物多樣性[8-9]、微生物活性[10]和酶活性[11-12]等方面影響的研究。Kama等[13]在肯尼亞的試驗發現,氮磷混施降低了細菌群落結構的多樣性,有機肥或有機無機肥混施能明顯影響微生物群落結構。Zheng等[14]在中國北部沙壤土的試驗發現,氮磷鉀混施對于FAMEs含量影響不顯著,有機肥或有機無機肥混施對微生物群落的FAMEs含量影響最大。Yu等[15]在淋溶土地上的施肥研究發現,無機肥的施用抑制生長,有機肥促進微生物的生長。張煥軍等[16]在對潮土的研究中發現長期施用有機肥改變了土壤微生物的群落結構,提高了細菌數量,降低了放線菌含量,而對真菌數量沒有明顯影響,陸海飛等[17]對紅壤性水稻土的研究中發現長期有機無機肥配施可顯著提高土壤細菌多樣性。由此發現,由于氣候條件、土壤類型以及耕作施肥的差異,無機肥對土壤微生物特性的影響結果不一致；但有機肥和有機肥與化肥混施對微生物影響的研究結果基本一致,表現為促進作用。

盡管關于施肥對土壤微生物影響的研究報道較多,但關于黃土丘陵區農業生產中占有很大的比重的川地農田,在這方面研究較少,尤其是長期施肥后土壤微生物群落結構的變化及施肥對土壤質量影響方面的報道更是缺乏。因此,探究施肥對農田微生物群落變化特征的影響,評價土壤性質變化及指導作物產量變化的分析具有重要意義。本試驗以黃土丘陵區安塞野外試驗站川地長期肥料試驗樣地的土壤為研究對象,分析不同施肥處理對土壤微生物群落多樣性及其活性的影響,明確影響土壤微生物學特征的關鍵因子,以期為該區域農田系統進行土壤質量評價,建立合理施肥制度、提高土地生產力提供數據支持和科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗于2011年在中國科學院安塞水土保持綜合試驗站進行,該站位于黃土高原中部(109°19′23″E,36°51′30″N),海拔1068—1309m。屬暖溫帶半干旱氣候,年均溫8.8℃,有效積溫(>10 ℃)為3114℃,年均降雨量535mm,60%的降水集中在7—9月,且多暴雨,干燥度1.48；無霜期160d。地貌類型為典型的梁峁狀丘陵溝壑區,溝壑密度8.06km/km2。土壤類型處于黃綿土與沙黃土交錯區,地帶性土壤為黑壚土,絕大部分已流失,黃土母質廣泛出露地表,主要為黃綿土。養分比較貧瘠,氮、磷缺乏,鉀富足。受自然條件和人類活動共同影響,水土流失嚴重。因無灌溉條件,靠天然降水,屬雨養農業地區,農作制一年一熟,以秋作物為主。

1.2 試驗設計

所選樣地位于墩灘川地養分長期定位試驗場,從1997年開始設置,為旱地,輪作方式為玉米-玉米-大豆。樣地面積378m2,每塊小區為14m2。本研究選擇8個處理：CK(對照)、N(氮肥)、P(磷肥)、M(有機肥)、NP(氮肥和磷肥配施)、MN(有機肥和氮肥配施)、MP(有機肥和磷肥配施)和MNP(有機肥、氮肥和磷肥配施)。小區隨機區組排列,每個處理布設了3塊樣地重復。有機肥用冬羊糞,氮肥為尿素,磷肥為過磷酸鈣,施肥量分別為N：97.5kg/hm2；P：75.0kg/hm2；M：有機肥(羊糞)7500kg/hm2。施肥方法為將有機肥和磷肥做種肥一次施入,尿素做種肥施總量的20%,余下80%的尿素在玉米大喇叭口期與抽雄期之間追施。

1.3 樣品的采集與測試分析

待作物收獲后,于2012年10月19日,采用S型取樣法采取了0—20cm和20—40cm兩層的土壤,裝在布袋中立即送回實驗室保存。剔除根系和凋落物后,分為2份,一份風干,然后分別過0.25mm篩和1mm篩。過0.25mm篩的用于測定土壤有機碳、全氮、全磷,過1mm篩的用于測pH、速效磷和堿解氮。另一份鮮土樣過2mm篩然后再分兩份,一部分放4℃冰箱貯存用于基礎呼吸和誘導呼吸；另一部分貯存于-80℃冰箱用于磷脂脂肪酸測定。

土壤理化性質采用常規測定方法[18]。土壤有機碳用重鉻酸鉀氧化-外加熱法；土壤全氮采用凱氏定氮法；土壤全磷采用硫酸-高氯酸消煮,鉬銻抗比色法測定；土壤堿解氮采用堿解擴散法；土壤速效磷采用碳酸氫鈉提取鉬銻抗比色法測定；pH值用pH計測定(水∶土=2.5∶1)。

土壤基礎呼吸(BR)和誘導呼吸(SIR)的測定參考Hueso等[19]采用紅外氣體分析儀測定。土壤微生物磷脂脂肪酸采用修正的Blight-Dyer法[20],取3.0g凍干土樣,通過氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液振蕩提取總脂,采用硅膠柱分離,分別以氯仿、丙酮、甲醇洗脫,收集甲醇分離液。甲脂化后,以酯化的C19:0為內標,用氣相色譜儀(GC7890A,Agilent Technologies) 進行測定,應用美國MIDI公司開發的Sherlock MIS4. 5系統分析鑒定微生物類群。PLFA的總量和單個PLFA的量可根據內標C19: 0進行計算,用nmol/g干土表示。

本文常見的13:0 iso、13:0 anteiso、14:0 iso、14:0 anteiso、15:1 iso w9c、15:0 iso、15:0 anteiso、16:0 iso、17:1 iso w9c、17:0 iso、17:0 anteiso、19:0 anteiso、22:0 iso表征革蘭氏陽性菌；12:1 w4c、15:1 w8c、17:1 w8c、18:1 w9c、18:1 w7c、19:0 cyclo w7c、20:1 w9c、22:1 w9c表征革蘭氏陰性菌；16:0 10-methyl、17:1 w7c 10-methyl、17:0 10-methyl、18:0 10-methyl表征放線菌；18:2 w6c表征真菌。

1.4 數據處理

利用SPSS 20.0統計分析軟件對施肥處理下各樣地土壤呼吸、誘導呼吸、代謝熵、土壤微生物群落結構進行單因素方差分析(one-way ANOVA)；利用三因素方差分析檢測氮肥、磷肥和有機肥對各指標的影響程度及其交互作用；利用R軟件中Redundancy analysis(RDA)分析環境因素對微生物群落結構變異的解釋程度及影響程度。

2 結果與分析

2.1 施肥對土壤呼吸的影響

0—20cm和20—40cm的基礎呼吸、誘導呼吸的變化趨勢基本一致,且0—20cm的呼吸強度和誘導呼吸強度高于20—40cm(圖1)。0—20cm土層中,與CK相比,除M和NP處理外,其余各處理均顯著提高了土壤的基礎呼吸,呼吸強度增幅達31.18%—53.76%；20—40cm土層中,與CK相比,僅MP和MNP處理對基礎呼吸強度產生顯著影響(P<0.05),其余各處理均無顯著性差異(圖1)。

耕作層各處理與CK相比,只有NP未對誘導呼吸產生顯著影響,其余各處理顯著增強土壤的誘導呼吸(P<0.05)(圖1),增加幅度為40.12%—139.38%；而在20—40cm土層中,與CK相比,僅MN、MP、MNP對誘導呼吸產生顯著性影響(P<0.05),其余各配施處理對誘導呼吸均未產生顯著性影響。

圖1 不同施肥處理的土壤基礎呼吸和誘導呼吸Fig.1 basal respiration and substrate—induced respiration under different treatments同一土層不同字母表示處理之間差異達到顯著水平(P<0.05)

2.2 施肥對土壤微生物群落結構多樣性的影響

不同施肥處理對土壤微生物群落結構構成產生顯著影響,但不同處理對不同群落結構影響不同(表1)。其中0—20cm土層,除了NP處理對總PLFA無顯著影響外不同施肥措施均顯著增加了G-PLFA和總PLFA含量,其中PM、NPM和NM增加幅度最大；總體來說,施肥處理增加了G+PLFA、放線菌PLFA和真菌PLFA含量,但僅PM、NPM等個別處理影響達到了顯著水平。真菌/細菌僅在PM和NPM兩個處理下顯著降低,其余處理均未顯著變化。施肥處理對20—40cm土層的影響弱于0—20cm土層,僅對G-PLFA、G+PLFA、放線菌PLFA和總PLFA含量產生了顯著影響,對真菌PLFA和真菌/細菌未產生顯著影響；其中G+PLFA 和放線菌PLFA僅在PM和NPM處理中顯著增加,其余處理均為產生顯著變化；施肥處理總體增加了G-PLFA和總PLFA含量,但M和NP兩個處理影響并未達到顯著水平,PM、NPM和NM增加幅度高于N和P處理。

2.3 施肥處理對土壤微生物特性影響的交互作用

通過對氮肥、磷肥和有機肥三因素方差進行分析,表明三因素對不同指標具有不同的作用,且呈現不同程度的交互作用(表2)。在0—20cm土層中,氮肥因素僅對放線菌PLFA有顯著影響(P<0.05),磷肥因素僅對真菌PLFA沒有顯著影響,有機肥僅對BR沒有顯著影響。氮肥和磷肥對放線菌PLFA外的其它指標具有顯著的交互作用,而與有機肥僅對總PLFA顯著交互作用。磷肥和有機肥對SIR、G+PLFA、細菌PLFA、放線菌PLFA和總PLFA具有顯著的交互作用,而它們和氮肥三者之間對幾個指標均沒有顯著的交互作用。20—40cm表2說明,20—40cm土層中,氮肥因素僅對放線菌和總PLFA有顯著影響,磷肥因素處理顯著影響土壤微生物的BR、SIR和G+PLFA和放線菌PLFA(P<0.05),有機肥顯著改變除真菌外的其它指標。氮肥和磷肥對SIR、G+PLFA、G-PLFA、真菌及總PLFA有顯著交互作用,而和有機肥的交互作用與0—20cm土層的結果相似僅對總PLFA產生顯著影響,磷肥和有機肥對G+、細菌、放線菌和總PLFA有顯著的交互作用,與耕層結果一致,氮肥磷肥和有機肥三者之間對幾個指標均沒有顯著的交互作用。

表1 不同施肥處理對土壤微生物特性的影響

同一行不同字母代表處理間差異顯著;G+PLFA Gram Positive PLFA;格蘭仕陽性菌PLFA G-PLFA Galanz negative 格蘭仕陰性菌PLFA

表2 氮、磷、有機肥對微生物呼吸、土壤微生物群落影響的三因素方差分析

BR: basal respiration,代表基礎呼吸; SIR: substrate-induced respiration,代表誘導呼吸;qCO2: metabolic quotient,代表代謝熵;G+PLFA: Gram Positive PLFA,格蘭仕陽性菌PLFA; G-PLFA: Galanz negative PLFA 格蘭仕陰性菌PLFA；CK: contorl空白處理;N: Nitrogen fertilizer氮肥添加;P: Phosphorus fertilizer磷肥添加;M: Manure有機肥添加;NP: Nitrogen fertilizer + phosphorus fertilizer氮磷添加;NM: Manure + nitrogen fertilizer氮肥和有機肥添加;PM:Manure + phosphorus fertilizer磷肥和有機肥添加;NPM: Manure + nitrogen fertilizer + phosphorus fertilizer氮磷和有機肥添加

2.4 微生物群落結構變化的驅動因素

在0—20cm土層中,對施肥處理樣地的土壤微生物群落PLFAs進行主成分分析,結果表明(圖2),主成分1(PC1)對總PLFAs數據變異的貢獻率為24.3%,主成分2(PC2)對總PLFAs數據變異的貢獻率為19.37%,累計貢獻率為43.67%。各施肥處理在圖中上分別成簇出現,主成分1和主成分2基本上能把不同施肥處理區分開,但是NP與NM的樣點分布部分重合,表明施肥處理改變了土壤微生物的群落結構。

圖2 0—20cm土壤各菌群磷脂脂肪酸(PLFAs)和環境因子的冗余分析Fig.2 Redundancy analysis of soil microbial PLFAs in 0—20cm and environmental variables CK樣地包括sit1、sit2、sit3；N樣地包括：sit4、sit5、sit6；P樣地包括：sit7、sit8、sit9；M樣地包括：sit10、sit11、sit12；NP樣地包括：sit13、sit14、sit15；NM樣地包括：sit16、sit17、sit18；PM樣地包括：sit19、sit20、sit21；NPM樣地包括： sit22、sit23、sit24。TPLFA：Total PLFA代表總PLFA含量,GP：Gram Positive代表革蘭氏陽性菌PLFA含量,GN：Gram Negative代表革蘭氏陰性菌PLFA含量,Fungi：真菌PLFA含量,Actinomycetes：放線菌PLFA含量,BR：基礎呼吸強度,SIR：誘導呼吸強度;******依次表示P≤0.001,0.001

在0—20cm土層中,以土壤微生物和土壤性質為因子進行冗余分析,土壤性質選取土壤有機碳(TOC)、總氮(TN)、總磷(TP)、堿解氮、pH、速效磷(aP)6個環境因子,對不同施肥處理的土壤微生物特性進行冗余分析。其中,第一軸解釋了58.46%的變異,第二軸解釋了4.7%的變異(如圖2)。結果表明,土壤因子中全磷和速效磷對于土壤微生物特性產生極顯著影響,全氮和堿解氮對微生物性質產生顯著影響。由圖2可知,pH對微生物性質有負向作用。

在20—40cm土層中,對施肥處理樣地的土壤微生物群落PLFAs進行主成分分析,結果表明(圖3),主成分1(PC1)對總PLFAs數據變異的貢獻率為19.63%,主成分2(PC2)對總PLFAs數據變異的貢獻率為17.16%,累計貢獻率為36.79%。主成分1和主成分2基本上能把不同施肥處理區分開,但是對照CK與NP配施出現分布重合。

在20—40cm土層中,同樣以土壤微生物和土壤性質為因子進行冗余分析,土壤性質選取土壤有機碳(TOC)、總氮(TN)、總磷(TP)、堿解氮、pH、速效磷(aP)6個環境因子,對不同施肥處理的土壤微生物特性進行冗余分析。其中,第一軸解釋61.6%的變異,第二軸解釋14.96%的變異(如圖3)。結果表明,土壤因子中速效磷對于土壤微生物特性產生極顯著影響,有機質、全磷和堿解氮對微生物性質產生顯著影響。由圖3可知,與0—20cm土層一致,pH對微生物性質有負向作用。

圖3 20—40cm土壤各菌群磷脂脂肪酸(PLFAs)和環境因子的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis of soil microbial PLFAs in 20—40cm and environmental variableCK樣地包括sit1、sit2、sit3；N樣地包括：sit4、sit5、sit6；P樣地包括：sit7、sit8、sit9；M樣地包括：sit10、sit11、sit12；NP樣地包括：sit13、sit14、sit15；NM樣地包括：sit16、sit17、sit18；PM樣地包括：sit19、sit20、sit21；NPM樣地包括： sit22、sit23、sit24。TPLFA：Total PLFA代表總PLFA含量,GP：Gram Positive代表革蘭氏陽性菌PLFA含量,GN：Gram Negative代表革蘭氏陰性菌PLFA含量,Fungi：真菌PLFA含量,Actinomycetes：放線菌PLFA含量,BR：基礎呼吸強度,SIR：誘導呼吸強度。******依次表示P≤0.001,0.001

3 討論

本研究發現,0—20cm土壤微生物的呼吸強度以及土壤微生物PLFA含量均比20—40cm土層高(圖1,表1),但兩個土層各指標的變化趨勢基本一致。其主要原因是,有機和無機肥料施于0—20cm表層土壤,對微生物產生直接影響,并且這一土層是耕作層,植物根系多分布于這一土層,可以滿足微生物的生長和繁殖需要,但是20—40cm土層中改變微生物特性的物質來自于表層物質下滲[21],其對土壤微生物特性的影響結果不如表層明顯。

3.1 N對于微生物特性的影響

在0—20cm土層和20—40cm土層中,單施N顯著提高土壤呼吸、G-和總磷脂脂肪酸含量,而對其他土壤微生物群落的脂肪酸含量影響不顯著。這可能是由于細菌C/N比真菌更低,這使細菌有更強的利用低C/N有機質的能力[22],施用N增加土壤氮的有效性,碳氮比降低,細菌更適應由于氮添加導致土壤C/N降低的環境而增加。目前長期施用N肥對土壤微生物群落影響的結果不盡一致。Bardgett等[23]發現,施用氮肥可能通過改變土壤養分有效性促進細菌生長,從而影響微生物群落。Yu等[24]的研究則指出,氮肥對真菌的促進作用最明顯。高明霞等[25]研究表明,長期施用N對于提高提高微生物多樣性沒有顯著作用。白震等[26]研究表明,單施N不僅對細菌或真菌無顯著影響,甚至對于微生物活性和結構影響都比較小。這可能是因為長期施用無機氮肥,使土壤的C/N比降低,加速了土壤中原有有機碳的分解,導致土壤中積累的有機碳總量較少,從而不利于微生物的積累[27]。并且不同地區土壤類型不同以及施肥種類和方式的多樣性也能導致單施氮肥結果的差異。

3.2 P對于微生物特性的影響

在0—20cm土層中,單施P能提高微生物的活性、顯著增加G-、放線菌和總PLFA含量；在20—40cm土層中,單施P能顯著提高土壤微生物的G-和總PLFA含量。氮磷有機肥配施的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及總PLFA含量均低于磷肥有機肥配施,主要原因是供試土壤作物的主要限制因子是P。施瑤等[28]在內蒙古草原進行6a的氮磷添加實驗,發現磷添加有助于提高土壤總磷脂脂肪酸、細菌、放線菌的磷脂脂肪酸含量。Li等[29]發現磷肥能夠增加真菌、細菌的PLFA的含量,但是真菌PLFA含量比細菌增加的快。這些與本試驗的研究結果基本一致。通過冗余分析發現,施入的磷肥主要是以速效磷的形式對植物及微生物產生作用,與白震等研究結果一致[30]。并且根據RDA分析,在0—20cm土層,主要是通過全磷和速效磷對微生物群落結構變化起驅動作用,在20—40cm土層,主要通過速效磷對微生物群落結構變化起驅動作用。這可能是由于黃土丘陵區土壤貧瘠,缺乏磷肥,所以施用磷肥能對微生物群落產生顯著的影響。本試驗結果表明氮磷肥混施對微生物群落結構的影響不顯著,與白震等[30]氮磷肥配施對微生物活性與結構影響較小的結果相一致。但Kamaa等[13]研究表明,氮磷混施抑制細菌的微生物群落結構。

3.3 M對于微生物特性的影響

在0—20cm土層,M對土壤呼吸沒有顯著影響；但在20—40cm土層中,單施有機肥顯著提高了土壤的誘導呼吸。單施M顯著提高0—20cm土層的G-和總PLFA含量；但在20—40cm土層,M并未對土壤微生物PLFA含量產生顯著性影響。通過三因素方差分析,結果表明有機肥這個因素在整個實驗中對0—20cm的土壤微生物PLFA含量產生顯著的影響,對20—40cm土層除真菌外的微生物PLFA含量產生顯著影響。張煥君等[16]在潮土的研究中發現,有機肥的長期施用提高了土壤微生物PLFA含量和細菌量卻抑制放線菌的生長。Zhong等[31]認為有機肥施用會顯著增加土壤細菌和放線菌的生物量。張奇春等[32]采用室內恒溫培養法發現施用有機肥顯著增加了土壤微生物群落結構的多樣性。分析其產生影響可能原因有：(1) 有機肥的施用提高了土壤中有機質的含量,而有機質既含有相當數量的碳、氮、磷、鉀等營養元素,又具有改善土壤理化性狀和土壤的結構、提高土壤肥力的作用,為微生物生長提供了良好的環境,從而促進微生物結構的多樣性和活性[33]；(2) 有機肥本身含有大量活的微生物、活性有機碳源和能源,會起到“接種”和“導入”作用[34]。

本試驗結果表明,有機無機肥配施對土壤微生物活性及結構影響顯著。Yuan等[35]對施肥超過25年的稻田進行研究,發現有機無機混施能增加微生物群落多樣性。這與本試驗的結果相一致,與其他施肥處理相比,有機無機混施,明顯改變微生物的群落結構。有機無機肥配合施用能提高微生物活性及改變微生物群落結構的原因是施肥增加根系生物量及根系分泌物,促進微生物生長繁殖,使土壤微生物量碳、氮含量明顯高于單施化肥的處理[36]。因此,長期有機無機肥配施能通過提高土壤細菌多樣性,并改變土壤細菌和真菌的群落結構,提高土壤酶活性,進而提高了農田生態系統的生產力并對生態系統健康有改善作用[2]。

4 結論

由于黃土丘陵區土壤貧瘠,土壤質量較差,通過分析可知P作為本區土壤的限制因子,施加P顯著增加土壤呼吸強度,改變了微生物群落結構,并且施用P肥以速效磷形式對微生物特性的變化起主要驅動作用。在黃土丘陵區農田,長期施用NPM有助于提高土壤微生物的特性,從而改善了土壤的生態環境,進而增強農田生態系統的穩定和健康。建立科學的施肥制度,通過有機無機配施等培肥措施提高土壤肥力的同時改善土壤生物學特性對于促進土壤生態系統穩定性、健康以及糧食產量有重要意義。

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