紅樹莓根莖水煎劑對昆明小鼠的急性毒性及安全性實驗研究

孫玉珍,方毅,李書丹，于曉紅*(.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 50040；.哈爾濱愛爾眼科醫院，黑龍江 哈爾濱 50076；.齊齊哈爾中醫院，黑龍江 齊齊哈爾 6000)

紅樹莓為薔薇科Rasaceae懸鉤子屬Rubus．L半灌木性聚合漿果植物，俗稱“托盤”“刺莓”“馬林”“覆盆子”，是中藥覆盆子家族的一員, 作為中藥材應用已有數千年的歷史。《本草綱目》中記載：“覆盆子氣味甘、平、無毒；益腎臟，治陽萎，縮小便；有益腎固精、補肝明目之功效。”在國外，紅樹莓已被人們作為良好的防病保健水果食用，并具有悠遠的藥用歷史[1]。民間紅樹莓也被廣泛應用，根、莖、葉均為入藥部位，有人將紅樹莓根莖煮水治療各種腫瘤，成為民間廣為流傳的偏方、驗方。目前對于紅樹莓的研究大多集中于其有效成分的開發或致力于國內種植方法的研究等[2-5]，而對于紅樹莓根莖抗腫瘤免疫機理方面的研究未見報道。基于前期就紅樹莓原液對免疫抑制小鼠的免疫調節機制進行的一系列實驗研究，本課題組首先觀察了紅樹莓根莖水煎劑對昆明小鼠的急性毒性及安全性，本文擬就其實驗數據進行報道，以期為紅樹莓抗腫瘤免疫調節機制的實驗研究及臨床應用提供基礎資料。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及條件

選用清潔級昆明種(KM)健康適齡小鼠60只，體質量18.0～20.0 g，雌雄各占一半，購置于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(黑)2013-012。給藥前和給藥后實驗小鼠雌雄均已隨機分籠，自由飲水，常規飼養，室溫22～26℃，濕度：50%～60%。

1.2 實驗藥物及制備

藥物：紅樹莓根莖采摘于黑龍江省尚志市帽兒山。將紅樹莓根莖切成小段、粉碎，備用。紅樹莓根莖水煎劑(RRD)制備：取粉碎紅樹莓根莖300 g，加入裝有5倍量清水煮水容器中，浸泡2 h，將浸泡液與藥材一起用武火煮沸后改用文火100℃加熱30 min，過濾，得藥液，將藥渣再加入5倍量的水，加熱100℃30 min，過濾去藥渣得藥液，并將兩次藥液混合加熱濃縮至54 mL，使生藥含量為5.56 g/mL，裝入藥瓶并放入4℃冰箱中保存。此水煎劑由黑龍江中醫藥大學微生物學與免疫學實驗研究室完成。

1.3 實驗器材

電子分析天平，METTLEY TOLEDO瑞士；無菌操作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；恒溫水浴鍋，北京市醫療設備廠；自動平衡離心機，北京醫用離心機廠。

2 方法和結果

2.1 預實驗：半數致死量實驗

2.1.1 預實驗方法

取清潔級昆明種(KM)健康適齡小鼠20只，雌雄各占一半，隨機分為正常對照組和紅樹莓根莖水煎劑組，每組各10只，分別給予標記，稱體質量。紅樹莓根莖水煎劑組以最大濃度為5.56 g/mL、最大耐受容積為0.04 mL/g給小鼠1次灌胃，灌胃藥量為222.4 g/(kg·d)給藥后常規飼養，自由飲水；正常對照組灌胃同紅樹莓根莖水煎劑組等量生理鹽水，其余處理同紅樹莓根莖水煎劑組。連續觀察7天，測量紅樹莓根莖水煎劑對昆明小鼠的半數致死量(LD50)。

2.1.2 預實驗結果

紅樹莓根莖水煎劑組小鼠給藥后精神狀態、反射活動稍有減弱，30 min后恢復正常。7天內紅樹莓根莖水煎劑組小鼠行為活動、飲食、大小便等與正常對照組比較無明顯差異；未見小鼠死亡。依據文獻[6-7]，因紅樹莓根莖水煎劑質量濃度和容積的限制,一次給藥無法測出紅樹莓根莖水煎劑(RRD)對實驗小鼠的半數致死量(LD50),為評價紅樹莓根莖水煎劑對實驗小鼠的安全性，故進行最大給藥量(MTD)實驗。

2.2 最大給藥量實驗

2.2.1 最大給藥量實驗方法

本實驗采取最大給藥量(MTD)法，取清潔級昆明種(KM)健康適齡小鼠40只，雌雄各占一半，隨機分為正常對照組和紅樹莓根莖水煎劑最大給藥組，每組20只，分別給予標記，稱體質量。最大給藥組以最大濃度為5.56 g/mL、最大耐受容積為0.04 mL/g給小鼠灌胃，每天2次，灌胃藥量為444.8 g/(kg·d)，灌胃間隔時間為8 h，其間前4 h不禁食,后4 h禁食，最后一次給藥后常規飼養，整個實驗過程均不禁水。正常對照組灌胃同最大給藥組等量生理鹽水，其余處理同最大給藥組。連續觀察7 d，在給藥后的第1天、第4天和第7天分別稱體質量。在禁食不禁水12 h后的第8天，稱體質量，摘除小鼠眼球取血約0.7～1.1 mL，靜置2 h，離心(3 000轉/min,10～15 min),取上清夜，移入EP管中備用。脫頸椎法處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒后，在無菌操作臺解剖小鼠，剝離主要臟器心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，剔除周圍結締組織和脂肪組織并稱重，放入4%多聚甲醛固定。用全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、GGT和BUN數值。用以下公式計算心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等主要臟器的臟器指數。臟器指數=臟器濕重/體質量(mg/g)。

2.2.2 觀察實驗指標

在實驗過程中，每天兩次定期觀察實驗小鼠，上午8：00點、下午2：00點，觀察記錄小鼠在給藥后的精神狀態、呼吸運動、行為活動、反射活動、飲水、進食、眼耳鼻分泌物、大小便排泄物、存活等情況；記錄給藥前和給藥后第1天,第4天,第7天各組實驗小鼠的體質量變化情況；檢測小鼠血清中的ALT、AST、GGT和BUN數值；觀察主要臟器心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟病理形態學的改變情況；檢查紅樹莓根莖對實驗小鼠主要臟器指數的影響(若中間有小鼠死亡應及時進行解剖)。

2.2.3 統計學方法

采用SPSS22.0進行統計學分析，在數據資料符合正態分布的情況下，采用均數±標準差表示，應用t檢驗統計分析，以P<0.05具有統計學意義。

2.2.4 最大給藥量實驗結果

2.2.4.1 對小鼠一般狀態及存活情況的影響

實驗結果顯示，最大給藥組小鼠在第二次灌胃后，出現精神萎靡、反射活動減弱、大便次數增加，2 h后恢復正常，2 h內眼、耳、鼻、口未見有異常分泌物。連續觀察7 d，最大給藥組小鼠在精神狀態、呼吸運動、行為活動、反射活動、飲水、進食、大小便等方面與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)。觀察期間無1例小鼠中毒死亡。

2.2.4.2 對小鼠體質量變化的影響

記錄各組小鼠給藥前和給藥后第1天、第4天和第7天的體質量，最大給藥組實驗小鼠的體質量在灌胃后的第1天較正常對照組明顯減輕(P<0.05)；但第4天、第7天的體質量增加，與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)。結果見表1。

2.2.4.3 對小鼠血液生化學指標的影響

檢測實驗小鼠的血液生物化學指標，結果顯示最大給藥組小鼠的血清中ALT、AST、GGT和BUN的數值，和正常對照組相比無明顯差異(P>0.05)。其結果見表2。

2.2.4.4 對小鼠主要臟器指數的影響

解剖分離實驗小鼠的主要臟器心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，記錄主要臟器的值量，比較臟器指數，結果顯示最大給藥組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟的臟器指數，與正常對照組比較，無統計學差異(P>0.05)。其結果見表3。

表1 對小鼠體質量變化的影響

表2 對小鼠血液生化學指標的檢測結果

表3 對小鼠主要臟器指數的檢測結果

2.2.4.5 對小鼠病理形態學的影響

肉眼仔細觀察最大給藥組和正常對照組小鼠被剝離的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等主要臟器，結果均未發現臟器萎縮、腫大、壞死等異常改變。對正常對照組和最大給藥組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等做病理形態學檢查，結果顯示，各組小鼠均未出現由受試藥物引起的中毒性的病理改變。

3 討論

實驗室前期在收集總結大量民間驗方實例的基礎上，首先就紅樹莓原液對免疫抑制機體的免疫調節作用進行了相關的實驗研究，實驗結果顯示，紅樹莓原液可通過促進小鼠脾臟、胸腺等免疫器官的發育，起到上調免疫功能的作用[8-9]。通過升高血清IFN-γ、IL-4水平，降低IFN-γ/IL-4，調節Th1/Th2漂移，以及增加免疫抑制小鼠胸腺和脾臟指數，來達到對環磷酰胺免疫抑制模型小鼠的免疫調節作用[10]。為評價紅樹莓的安全性，本課題組對紅樹莓根莖水煎劑(RRD)在昆明小鼠體內的急性毒性實驗進行了研究。

本研究結果表明，以最大濃度為5.56 g/mL、最大耐受容積為0.04 mL/g給小鼠1次灌胃，生藥量為222.4 g/(kg·d)做預實驗，即半數致死量(LD50)實驗。紅樹莓根莖水煎劑組小鼠僅在給藥當天精神狀態、反射活動稍有減弱，20 min后恢復正常，可能和藥物刺激有關。連續觀察7 d未見實驗小鼠中毒死亡或其他異常情況，說明紅樹莓根莖水煎劑(RRD)無明顯急性毒性，無法檢測半數致死量(LD50)。為評價紅樹莓根莖水煎劑的安全性進行了小鼠的最大給藥量(MTD)實驗，以最大濃度為5.56 g/mL、最大耐受容積為0.04 mL/g給小鼠灌胃每天2次，生藥量為444.8 g/(kg·d)。最大給藥量(MTD)實驗結果顯示，最大給藥組小鼠在第二次灌胃后，出現精神萎靡、反射活動減弱、大便次數增加，2 h后恢復正常。連續觀察7 d，最大給藥組小鼠在精神狀態、呼吸運動、行為活動、反射活動、飲水、進食、大小便等方面，與正常對照組相比，無明顯差異(P>0.05)，觀察期間無1例小鼠死亡。最大給藥組小鼠體質量僅在灌胃后第1天較正常對照組明顯減輕(P<0.05),第4天、第7天體質量增加與正常對照組比較無顯著差異(P>0.05)。肉眼仔細觀察正常對照組和最大給藥組小鼠被剝離的主要臟器心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等結果顯示，各組小鼠均未發現臟器萎縮、腫大、壞死等異常改變，進一步對實驗小鼠的主要臟器做病理形態學檢查結果顯示，各組小鼠均未出現由受試藥物引起的中毒性的病理改變。血液生化學指標和臟器指數指標均無統計學意義(P>0.05)。

在藥物急毒實驗中，半數致死量(LD50)是一個重要的評價指標，其值越高，藥物的可能毒性就越小，本動物實驗未測出紅樹莓根莖水煎劑灌胃小鼠的半數致死量(LD50)，表明紅樹莓根莖水煎劑的毒性很低。最大給藥量(MTD)實驗是指一日內單次或多次(2～3次)以允許的最大給藥劑量給藥，在一定期間出現的毒副反應。本實驗以最大濃度和最大耐受容積給小鼠灌胃，最大給藥組小鼠和正常對照組小鼠均未觀察到明顯的毒性反應，整個實驗過程中未見小鼠中毒死亡。在本次實驗設計中，紅樹莓根莖水煎劑(RRD)對昆明小鼠的最大給藥量為444.8 g/(kg·d)。

綜上所述，通過紅樹莓根莖水煎劑對昆明小鼠的急性毒性實驗，結果顯示紅樹莓根莖水煎劑對昆明小鼠無明顯的急性毒性作用，血液指標及臟器指標無異常，表明紅樹莓根莖水煎劑具有較高的安全性。

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