中藥成分腸吸收模型研究進展與思考

何帥，藺明煊，姜亦南，王少男，石晉麗(北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488)

中藥化學成分復雜，因傳統研究模式周期長、難度大，導致多數中藥材有效成分不清楚；中藥有效部位的開發是中藥材利用的重要途徑，存在著組成和比例不清、忽視非有效部位的協同作用等問題，導致其質量控制水平不高，療效難以充分發揮。因此，探索快速、簡便篩選及優化中藥有效成分群及其比例的方法，具有很好的理論和實際意義。中藥腸吸收譜與藥物譜、藥效譜結合可以快速、簡便地篩選、優化中藥材有效成分群。中藥腸吸收模型的應用較為廣泛，多用于研究結構和活性較為明確的中藥單體、單味中藥和中藥復方的有效吸收成分及其相互作用規律[1]。目前關于藥物腸吸收研究的綜述較多，但是大部分只針對某一種或三種主要的腸吸收模型(單向腸灌流法、循環腸灌流法、外翻腸囊法)進行應用及優缺點的總結，不夠全面和深入。鑒于此，本文總結了包括體外法(大鼠腸囊、尤斯灌流室Ussing Chamber法、細胞培養模型法、平行人工膜滲透模型法等)、在體法(單向腸灌流法，循環腸灌流法，腸襻法等)以及體內法(血液、尿液藥物濃度法)三大類型[2]在內的近幾年國內外有關腸吸收的實驗模型，并對各種方法的準確性和可信度進行描述，對各種方法的不足之處進行探討，全面而深入地總結了各種模型在實驗過程中的注意事項，為中藥有效成分群篩選的相關研究提供參考，進而為中藥新藥的發現和臨床上中藥的合理使用提供借鑒。

1 體外法

體外法(ex vivo/in vitro)分為兩類：一類是分離動物腸黏膜/腸段來評價藥物腸吸收；另一類是分離人腸細胞并給予模擬的腸環境，進而分析藥物的腸吸收情況[3]。常用的體外法模型主要有大鼠腸囊法、尤斯灌流室法、細胞培養模型法、平行人工膜滲透模型法。

1.1 大鼠腸囊法

1.2 尤斯灌流室法

1951年，丹麥學者Hans Ussing首次將Ussing chamber (尤斯室，或尤斯灌流室)介紹于世，其主要功能是通過給離體上皮組織提供一個模擬體內生理條件的環境，并利用電壓電流鉗技術，研究營養物質、藥物及離子等跨上皮的轉運。Ussing Chamber技術是目前常用的研究藥物胃腸道吸收的體外方法之一，通過微電極檢測整個細胞膜離子通道變化的電流信號，來反映腸道藥物吸收、通透性和分泌情況的變化[9]。該方法[10]是將適當大小的腸黏膜固定在相互連接的黏液和漿膜液之間，在各孔之間插入槽，測量藥膜兩側的藥量，計算藥物從黏膜到漿膜吸收率。該模型研究葵酸脂對腸P-糖蛋白底物轉運的影響[11]。結果表明葵酸脂可能作為P-糖蛋白抑制劑改善受P-糖蛋白介導的藥物的吸收，增強口服藥物的生物利用度。具有以下優點：①研究藥物特定腸段的吸收、分泌過程；②可以研究藥物轉運的不同階段；③操作簡便快捷；④能更準確地反映體內各種上皮細胞的實時狀態[12-13]。但其缺點為：①該數據較少且較為簡單，而腸黏膜系統較為復雜，因此可靠性真實性較差；②從獲得腸上皮到尤斯灌流試驗通常需要1 h以上，此期間缺乏血液和神經供應，手術進程中組織的形態和結構容易破壞，生物活性必然下降，影響實驗結果[14]。目前的解決方法是在運輸液中加入組織活性防腐劑來保持或減少腸道形態和生理活性的下降，未來有待于出現一種新的方法來保持腸段的生物活性，來保證結果的可靠性。

1.3 細胞培養模型

研究細胞和分子水平的藥物吸收模型有很多，如Caco-2，HT29-MTX細胞模型等。Caco-2細胞是人類結腸腺癌上皮細胞，在培養的過程中可以自行分化成類似人成熟的小腸上皮單層細胞，含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶，能夠在細胞水平提供關于藥物分子通過小腸黏膜的吸收、代謝、轉運信息[15]。因此，Caco-2細胞模型做為研究小腸上皮細胞藥物轉運和代謝的體外模型，廣泛應用于口服藥物的篩選和藥物腸吸收過程的研究[4,16]。方法為：(1)培養細胞：將細胞培養復蘇、傳代；(2)種板：將培養過的細胞放于聚碳酸酯膜上；(3)檢測：進行單層細胞級性和完整性檢測，測量電阻值TEER，并進行熒光素鈉轉運實驗及堿性磷酸酶活性測定、細胞攝取、細胞轉運實驗。整個裝置在培養基中進行，細胞板頂側放藥物，底側檢測。該方法優勢[17]為：①方便簡捷：Caco-2細胞容易培養，有強大的生命力；②能夠測定藥物的細胞攝取和細胞跨膜轉運；③Caco-2細胞與腸上皮細胞具有藥物代謝相似的酶類，可以檢測代謝條件下藥物的跨膜轉運；④Caco-2細胞的來源是人結腸癌細胞，具有良好的同源性；⑤可以用來區分不同的腸道吸收通道。但也有一定缺點：①缺少腸壁的黏液層，與真實環境有差異，結果可能有誤差；②缺少細胞異質性(單一細胞構成)；③缺少部分代謝酶；④Caco-2細胞屏障特性與結腸上皮細胞類似，而與小腸上皮細胞有一定差別；⑤所需助溶劑多有毒性。Caco-2模型現已被認為是小分子藥物口服吸收的體外篩選模型，并且適用于藥物開發的早期階段以研究藥物吸收過程。但該模型僅為細胞水平上的研究，若要提高實驗結果的準確性還需進一步與整體動物實驗相結合[15]。

1.4 平行人工膜滲透模型

平行人工膜滲透模型(PAMPA)主要是將人造磷脂作為生物膜去模擬藥物跨膜屏障進行藥物膜通透研究。具有高通量、低成本、用藥量少、靈活性高等優點[18],是研究藥物通過生物膜吸收的理想的體外模型。然而也存在局限性，例如只有被動擴散機制，較為單一，對親脂性的小分子化合物不能闡明是由旁細胞滲透途徑還是被動擴散途徑穿過細胞膜，且無法精確預測主動轉運機制下的藥物滲透率。Caco-2細胞、MDCK細胞模型與平行人工膜滲透模型聯用，是避免上述問題的有效方案。平行人工膜滲透模型作為藥物的初步篩選工具已經被廣泛應用，且具有不可代替的優勢。

2 在體法

在體法(in situ)是動物水平上的實驗。常用方法包括單向在體腸灌流法、循環腸灌流法、腸襻法。

2.1 在體腸灌流法

該法是通過測定藥物經腸段后灌流液損失的量而計算藥物滲透系數的方法，能夠從器官灌流水平研究藥物在不同濃度、pH等條件下結腸、回腸、空腸、十二指腸的吸收[7]。以下分別介紹單向腸灌流和循環腸灌流法。

2.1.1 單向腸灌流法

取大鼠，麻醉，保持體溫。腹部插管連接蠕動泵，用K-r液平衡，然后灌入藥物，定期抽取樣品以測量藥物濃度隨時間的變化。吸收速率常數(Ka)、膜表觀滲透系數(Papp)等動力學參數是其主要檢測指標。該模型優勢為：①操作簡便；②保證腸道神經的完整性及體液的供應，指標更加接近動物體內的真實吸收情況；③測得的吸收速率等指標與人體的體內吸收具有一定的相關性[19]；④模型已被美國FDA認可，應用更廣泛。但該模型也有一定缺陷：①膽汁進入十二指腸會對腸中藥物成分的吸收產生影響，需要將膽汁引流或膽管結扎；②灌流管路對藥物成分產生物理吸附，在實驗前需要對灌流管路進行飽和；③灌流液需要較高的溶解度，若極性小的藥物如環烯醚萜類需要加入吐溫-80、CMC等助溶劑，但助溶劑有毒，用量不規范容易造成溶血等副反應；④腸道會對灌流液中的水分吸收、排泄，應采用重量法進行校正，不易計算藥物吸收率。實驗過程中應注意：在灌流之前需要矯正蠕動泵的流速，其理論值和實際值往往有差別；大鼠麻醉時應使用烏拉坦，同時應注意麻醉劑的用量，使得大鼠保持麻醉良好的狀態，若中途大鼠恢復意識，應注意及時補充麻醉劑；腸灌流時應注意大鼠腸道的擺放應盡量避免有死角出現，否則藥液無法勻速流出，影響實驗結果；實驗過程中要時刻注意大鼠腸管外壁保持溫度和濕度，否則易干澀影響其生物活性。總之，單向在體腸灌流法應用較為廣泛，適用于多數藥物腸道吸收的研究。

2.1.2 循環腸灌流法

循環腸灌流與單向在體腸灌流的不同之處在于其灌流系統為循環式，灌流液可循環利用。鞏仔鵬[20]采用循環腸灌流法檢測出羊耳菊提取物9種成分在小腸均有吸收，但各成分的吸收速率、最佳吸收部位及吸收機制不盡相同。雖然國內常用循環灌流模型，操作上較單向腸灌流更簡便，但該方法灌流時間較長，速度較大，對腸黏膜損傷較大，易導致腸吸收值偏大，而單向在體灌流法因只考察某一段腸，所需流速較低，吸收速率穩定，對腸黏膜損傷較小[21]。

2.2 腸襻法

麻醉大鼠，打開腹腔，選擇所要研究部位的腸段，結扎而形成腸襻。方法為將藥液灌注于腸襻中，一定時間過后，取出腸襻，測定腸襻中的剩余藥量，來觀察藥物在腸中的吸收情況。該法優勢為：①沒有切斷血管和神經，腸段完整性高，結果更準確客觀。②不用排出腸內容物，與在體腸灌流法比較，其操作較為簡單。然而，由于存在腸內容物，其樣品處理較為復雜，所以實驗數據的準確性也較差，不適合大規模的藥物篩選評價，但是仍可作為其他模型的有益補充[22]。

3 體內法

體內法(in vivo)主要為動物的體內研究。經口給藥后，在不同時間點采集血液、尿液等(全血和血漿都可用于進行測定)，用HPLC測定藥物濃度，繪制體內藥物的經時曲線，計算Cmax、Tmax等藥動學參數來評價藥物吸收的速度和程度。其優點為：體內法為全身代謝法，接近于體內條件，能夠最真實地反映藥物在體內的總體吸收情況。其缺點為：①個體動物間的巨大變異，可能導致實驗的平行失調，所以需要大量的實驗動物，大劑量的藥物，大量的研究時間；②實驗周期長，影響因素復雜；③由于某些疾病可能影響腸道的吸收和代謝，因此應該慎重考慮是選擇病理模型還是正常動物進行吸收研究[12,22]。

綜上所述，體外法的優勢在于操作簡單，節約時間，但是無法保證血液的正常供應和神經系統的完整性，生物活性相對較差，實驗結果與真實情況有所偏差，所以該模型可用于早期藥物高通量的篩選，或者與在體和體內模型相結合，來全面反映藥物在腸道的吸收情況；在體法的優勢在于操作簡單，保證了血液的正常供應和神經系統的完整性，可以較為真實地反映藥物在腸道的吸收，目前應用較為廣泛，可與體外法相結合來全面反映藥物在腸道的吸收；體內法的優勢在于最能夠反映藥物在體內的吸收情況，但實驗周期長，影響因素多，無法特異性地反映藥物在腸道的吸收情況。總的來說，實驗結果的真實性準確性為：體內法>在體法>體外法；操作及裝置的簡捷性為：體外法>在體法>體內法。所以，要想全面真實的地反映藥物在腸道的吸收情況，需將幾種模型結合，優勢互補。

評價腸道藥物吸收情況的方法有很多，且不同的研究方法均能夠從不同的角度了解藥物腸內藥物的吸收情況。但每一種方法均有各自的優缺點。在體腸灌流法是現在應用最為廣泛的方法，國內使用循環灌流法較多，然而國外傾使用單向灌流法較多，其中單向灌流法可用于研究大部分的藥物吸收。腸襻法應用較為局限，但可以輔助其他實驗模型。僅來自一種腸吸收模型的數據不能提供確定的結果，因此，在研究不同的藥物時可同時使用兩種或兩種以上吸收模型。實驗人員應該熟悉每一種模型的應用，每一種模型的優缺點，進而更合理地利用腸吸收模型并對實驗結果進行辯證觀察，得出最客觀的結論。隨著醫學知識和技術的進一步發展，相信未來會研究出更為完善的腸道吸收模型，可快速篩選中藥有效成分群，進而為中藥新藥的發現和臨床上中藥的合理使用提供借鑒。

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