禽腺病毒4型實時熒光PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

楊金興，張玉霞，李 莉，袁小遠(yuǎn)(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，山東 濟(jì)南 250023)

禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AV)根據(jù)抗原性差異可以分為3個群，其中Ⅰ群是傳統(tǒng)的禽腺病毒，包括從雞分離到的12個血清型、火雞2個血清型、鵝3個血清型和鴨2個血清型[1-2]。禽腺病毒可以引起禽包涵體肝炎、心包積液、肌胃糜爛等病變。自2015年6月起，山東省部分地區(qū)的肉雞中爆發(fā)了一種以傳染速度很快、死亡速度快、死亡率高的傳染病，臨床以心包積液為主要病變特征[3]。經(jīng)鑒定，最終確定病原為Ⅰ群禽腺病毒。目前，血清分型表明山東地區(qū)流行的禽腺病毒主要是血清4型和8 a/b型，該病毒造成雞群的死亡率較高，經(jīng)濟(jì)損失較大[4-5]。

本研究根據(jù)GenBank中的FAV血清4型的基因組序列，在保守區(qū)域設(shè)計了特異性擴(kuò)增引物和探針，建立了FAV的實時熒光PCR檢測方法，可用于4型FAV樣品的實驗室檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

4型FAV分離毒株GF16和WF816由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所分離鑒定。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

參照GenBank中FAV的基因組序列，設(shè)計引物FAV-FQ-F、FAV-FQ-R、探針P的5’-3序列分別為CTAGGGTTCTGAACTTTG、CGGTAAACATTTCA AGGA和TGACGCCAGTTTCGCTTTCG，探針用FAM和Eclipse熒光染料標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。引物及探針均由TaKaRa(大連)公司合成，級別均為HPLC級。

1.2.2 實時熒光PCR

選取雞FAV分離毒株GF16和WF816進(jìn)行檢測，設(shè)血清8型和水作為對照。病毒DNA的提取按照TaKaRa DNAiso試劑操作進(jìn)行，最后用30 μL超純水來溶解DNA。

Real-time PCR實時熒光PCR采用Probe qPCR進(jìn)行，反應(yīng)體系如下：Probe qPCR 緩沖液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，探針1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反應(yīng)體系為：95 ℃ 30 s，隨后95 ℃ 5 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s進(jìn)行40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后觀察熒光曲線。同時取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗。以100 bp DNA Ladder的標(biāo)記物作為參考，TAE緩沖液為電泳緩沖液，電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 臨床應(yīng)用

對42份疑似禽腺病毒感染樣品進(jìn)行上述方法檢測，后續(xù)進(jìn)行病毒分離、序列測定等來驗證建立的實時熒光PCR的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光PCR擴(kuò)增

禽腺病毒4型的GF16分離毒株和WF816分離毒株實時熒光PCR擴(kuò)增曲線良好(圖1)，2份樣品的2個平行樣品的Ct值基本一致，為19.3和19.8；陰性對照組未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增得到預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，約150 bp，陰性對照組在此處未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖2)。

圖1 禽腺病毒4型樣品的擴(kuò)增曲線

M為100 bp DNA Laddar Marker；1為樣品的PCR擴(kuò)增條帶；2為陰性對照圖2 部分樣品的電泳結(jié)果

2.2 敏感性

將模板DNA進(jìn)行10倍的倍比稀釋，隨后同樣進(jìn)行實時熒光PCR進(jìn)行敏感度的檢測。結(jié)果表明，本技術(shù)的檢測最小量可為100拷貝·μL-1。本方法設(shè)計合成的雙標(biāo)記熒光探針和引物，擴(kuò)增曲線良好；電泳結(jié)果顯示目的條帶清晰，說明探針引物性能良好。

2.3 臨床應(yīng)用

對42份疑似禽腺病毒感染樣品進(jìn)行檢測后證實，檢測到14份陽性樣品。經(jīng)后續(xù)的病毒分離、序列測定等證實建立的實時熒光PCR檢測法特異性高，該方法可快速靈敏準(zhǔn)確地檢測禽腺病毒4型，極大地縮短檢測時間，同時避免了普通PCR檢測出現(xiàn)的的假陰/陽性情況。因此，本研究所建立的探針實時熒光PCR檢測技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于FAV樣品的實驗室檢測。

3 討論

本研究建立了可用于檢測禽腺病毒4型的特異性方法。本方法特異性強，與其他幾種家禽主要疫病病毒(8 a/b型FAV、NDV、H9亞型AIV、IBDV)均無交叉反應(yīng)，所以建立的實時熒光PCR技術(shù)可用于臨床檢測。

我國主要流行6個血清型的禽腺病毒(火雞1型、禽1型、4型、5型、8 a/b型)，感染雞群的發(fā)病快、死亡率較高[6-7]。禽腺病毒多存在于禽類的呼吸道和消化道，多數(shù)呈隱性帶毒，但是一旦機體抵抗力下降就會引起發(fā)病，而且往往與其他病毒混合感染，導(dǎo)致死亡率提高[8]。鑒于禽腺病毒的發(fā)病特征和近幾年來我國的高傳播性分布特征，加強本病的快速診斷尤為重要。

參考文獻(xiàn)：

[1] PARK H S, LIM I S, KIM S K, et al. Molecular analysis of the hexon, penton base, and fiber-2 genes of Korean fowl adenovirus serotype 4 isolates from hydropericardium syndrome-affected chickens[J]. Virus Genes, 2016:1-6.

[2] KAN F, FUJIMOTO Y, UJINO A, et al.Gallusgalluscoxsackievirus and adenovirus receptor facilitates the binding of fowl adenovirus serotype 1 in chickens[J]. Japanese Journal of Veterinary Research, 2016, 64(3):183-190.

[3] 王娟, 劉亮亮, 李慧昕,等. 禽腺病毒血清4型的分離鑒定及遺傳演化分析[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2017(6):755-761.

[4] LI H, WANG J, QIU L, et al. Fowl adenovirus species C serotype 4 is attributed to the emergence of hepatitis-hydropericardium syndrome in chickens in China[J]. Infection Genetics & Evolution, 2016, 45:230-241.

[5] 李曉林, 王相芹, 羅濟(jì)冠,等. Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及其致病性研究[J]. 中國動物檢疫, 2016, 33(8):86-89.

[6] YE J, LIANG G, ZHANG J, et al. Outbreaks of serotype 4 fowl adenovirus with novel genotype, China[J]. Emerging Microbes & Infections, 2016, 5(5):e50.

[7] 牛登云, 沈元, 王蕊,等. 2015年我國Ⅰ群禽腺病毒分子流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國家禽, 2016, 38(9):65-68.

[8] 姚克昌, 劉月月, 游國進(jìn),等. 西南部分地區(qū)Ⅰ群禽腺病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及致病性研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2017, 29(11):1809-1818.