棘胸蛙白內障病原的分離、鑒定及藥物敏感性分析

吳明皇，林 玲，孫承文，王英英，石存斌*(.平陽縣漁業技術推廣站，浙江 溫州 35400； .中國水產科學院珠江水產研究所，廣東 廣州 50385)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗稱石蛙、石雞，具有較高的營養價值。上世紀80年代開始人工馴養，隨著人工繁殖技術的日漸成熟[1-3]，養殖規模不斷擴大，再加上養殖密度的提高、養殖管理和疾病防治措施等方面存在不足，導致棘胸蛙的病害也相繼增多，如爛皮病、嗜水氣單胞菌病、歪頭病、白內障等[4-10]，給養殖業造成了巨大的經濟損失。2013年開始，溫州市蒼南地區棘胸蛙流行一種以“白內障”為主要特征的疾病，臨床癥狀表現為病蛙眼睛白濁、頭部歪斜、厭食。該病傳染性強、死亡率高，使用多種藥物效果都不明顯，對養殖戶帶來極大的損失。根據國內外報道，引起蛙“白內障”的病原有：金黃色葡萄球菌、氣單胞菌、醋酸鈣不動桿菌、布氏檸檬酸桿菌、腦膜炎敗血金黃桿菌(腦膜敗血伊麗莎白菌)等[10-15]，由于引起“白內障”的病原菌種類多樣，為了解決這一問題，筆者對棘胸蛙“白內障”病原進行了分離鑒定，人工感染試驗確定病原菌，并進行抗生素藥敏試驗，以期為該病的診斷和防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

患病棘胸蛙取自蒼南縣赤溪鎮鳳陽社區棘胸蛙養殖場，50～300 g大小不等，眼球白濁，部分頭部歪斜，在水面上打轉。健康棘胸蛙由蒼南縣藻溪鎮石蛙養殖場提供，體重50～100 g，該養殖場沒有發生過此類疾病。

營養瓊脂、營養肉湯培養基等購自北京陸橋技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自上海銘博生物科技有限公司；DNA提取試劑盒購自愛思進(Axygen)生物科技有限公司；PCR有關試劑購自天根生化科技有限公司；ATB細菌鑒定條購自法國生物梅里埃公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。其他常規試劑由實驗室自行配制。

1.2 細菌的分離

取“白內障”病狀的棘胸蛙，按照常規無菌操作方法，用75%酒精進行體表消毒，用接種環從腦、肝臟中取組織接種于營養瓊脂平板上，于28 ℃恒溫培養24 h，挑取優勢菌落劃線分離，進行純化培養。純化后菌落用于人工感染和鑒定試驗。

1.3 人工感染試驗

將純化后的分離菌接種于營養肉湯培養基中，28 ℃搖床培養18 h，離心收集菌體，用生理鹽水稀釋成3×108mL-1菌懸液，采用大腿注射法進行人工感染，每只蛙注射0.2 mL菌懸液，對照組注射0.2 mL生理鹽水。感染后分別飼養在塑料水族箱中，進行日常管理，試驗期間水溫20～25 ℃，每日觀察、記錄發病和死亡情況，并進行病原再分離。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態學觀察

將菌株接種于普通營養瓊脂平板，28 ℃恒溫培養24 h，觀察菌落形態，并對細菌進行革蘭氏染色，油鏡下觀察菌體形態特征。

1.4.2 細菌生理生化鑒定

生理生化特性測定參照ID 32 E(法國生物梅里埃公司)生化鑒定條說明書進行。

1.4.3 細菌16S rRNA基因序列分析

用基因組提取試劑盒提取細菌的全基因組DNA，采用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，擴增上游引物8F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，下游引物1492R：5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性5 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物純化后，送至上海生工生物工程有限公司進行測序。根據測序結果，在NCBI中用BLAST進行同源性比較。

1.5 藥物敏感性試驗

采用藥敏紙片瓊脂平板擴散法。將病原菌劃線接種于營養瓊脂平板中，培養18 h后用生理鹽水洗下菌苔，再用生理鹽水稀釋為0.5 倍麥氏濃度后，用棉拭子蘸取菌液均勻涂布培養基表面，然后用鑷子將藥敏紙片貼在瓊脂平板表面，控制好紙片間的間距，28 ℃恒溫培養12～16 h 后測量抑菌圈大小，并參照杭州天和微生物試劑有限公司的藥敏試驗判斷標準來判定結果。

2 結果

2.1 患病棘胸蛙主要癥狀

病蛙最為明顯的癥狀是兩個眼球變白(類似白內障，圖1)，有些出現運動機能失調，在水面上打轉。

圖1 患病棘胸蛙眼部特征觀察

2.2 人工感染

肌肉注射感染健康棘胸蛙7 d后，試驗組10只蛙全部出現白內障癥狀并開始死亡，15 d后試驗組死亡率100%(表1)，與自然發病癥狀基本相同。對照組全部存活。從人工感染的棘胸蛙腦部和肝臟分離得到與PY-SW1506特征一致的菌株，說明分離菌株對棘胸蛙具有較強的致病力。

表1 人工感染試驗結果

2.3 分離鑒定

2.3.1 病原形態特征

從肝臟和腦組織分離的兩株菌，形態大小一致，革蘭氏染色觀察為陰性短桿菌(圖2)，在培養基上形成的菌落呈圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊，微凸，呈微黃色。

2.3.2 生理生化鑒定

根據表2病原菌的生理生化特征，經過全自動微生物分析系統鑒定為腦膜敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingiameningosepticum)。

圖2 經革蘭氏染色后的細菌形態(×1 000)

表2 分離病菌的生理生化鑒定結果

2.3.3 細菌16S rRNA基因序列

PCR擴增病原菌的16S rRNA基因片段大約為1 418 bp，對序列進行同源性分析發現，與GenBank上收錄的腦膜敗血伊麗莎白菌(GenBank：HQ154560.1)和腦膜炎敗血金黃桿菌(Chryseobacteriummeningosepticum)(GenBank：AY468482.1)菌株有99%同源性，因此鑒定該菌株為腦膜敗血伊麗莎白菌。

2.4 藥物敏感性

測定了致病菌對26種藥物的敏感性(表3)， 結果顯示對恩諾沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、萬古霉素、多西環素、利福平等7種藥物高度敏感，對鏈霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢西叮等4種藥物中度敏感，對氨芐西林、青霉素、頭孢唑林等15種藥物表現為耐藥性。

表3 致病菌對26種藥物的敏感性

注:S表示敏感；I表示中度敏感；R表示耐藥。

3 討論

本文對患“白內障”的棘胸蛙進行細菌分離，將分離得到的細菌對健康棘胸蛙進行了攻毒感染試驗，并通過生理生化和16S rRNA基因序列分析確定了棘胸蛙“白內障”的病原是腦膜敗血伊麗莎白菌。

腦膜敗血伊麗莎白菌，曾稱腦膜炎敗血金黃桿菌、腦膜炎敗血黃桿菌，屬于黃桿菌綱，黃桿菌目，黃桿菌科，伊麗莎白菌屬，廣泛存在于自然環境中，該菌能引起新生兒暴發性腦膜炎、敗血癥等[16-17]，在水產養殖中，對蛙、鱉、黃鱔等多種水生動物具有較強的致病性[18-20]，它能通過血腦屏障直接侵入大腦，張奇亞等[21]對患旋游癥美國青蛙進行病理組織切片觀察，認為腦膜炎敗血金黃桿菌引起腦組織受損，腦功能障礙，視覺功能減弱或逐漸喪失，這也是為什么由腦膜敗血伊麗莎白菌引起的“白內障”病蛙通常伴隨著頭部歪斜、狂游、身體失去平衡或浮于水面打轉等癥狀的主要原因。

藥敏試驗表明，腦膜敗血伊麗莎白菌具有較強的耐藥性，試驗中致病菌對26種藥物的藥敏試驗結果表明，僅恩諾沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、萬古霉素、多西環素、利福平等7種抗菌藥物對該菌有較好的抗菌作用。但是在生產上，我們分別使用了強力霉素和恩諾沙星來治療，效果均不明顯，可能的因素：1)由于這些藥物難以通過血腦屏障深入到大腦和眼部；2)腦組織和視覺神經損傷的不可逆性，視覺不能完全康復，導致病蛙尋找不到食物，最終還是因為饑餓而死。這也可能是腦膜敗血伊麗莎白菌危害極大并難以治療的原因。

腦膜敗血伊麗莎白菌是致病力強、耐藥性強的病菌，養殖戶應高度重視，在生產上更應以防為主，主要控制好養殖環境和增強體質，食用優質餌料和接種疫苗提高抗病力[22]。對蛙、水體、餌料及生產用具進行定期或不定期的消毒，一旦發現病蛙應及時清理，以免交叉感染。

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