心房鈉尿肽在基因敲除小鼠黑色素瘤肺轉移中的作用

亓翠玲，曹靜樺，何亞軍，李倩明，李夢詩，楊　揚，王麗京

(廣東藥科大學，基礎學院血管生物學研究所，廣州　510006)

鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)家族是人們在心和腦中發現的一種與水鈉代謝有關的肽類激素家族，包括心房鈉尿肽[1]、腦鈉肽(BNP)[2]、C-型尿鈉肽(CNP)[3]和樹眼鏡蛇性利尿鈉肽(DNP)[4]。心房鈉尿肽是由心房合成并儲存的的一種活性多肽，具有利鈉利尿、擴張血管、降低血壓等作用。心房鈉尿肽與高血壓、心和腎功能不全、妊娠相關疾病及肺水腫等疾病具有密切的關系。但是，關于ANP對腫瘤發生發展的作用報道不多，本文利用ANP敲除小鼠建立黑色素瘤肺轉移模型，研究ANP對黑色素瘤肺轉移的作用。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

ANP敲除純合子小鼠(ANP-/-)，由耿建國教授惠贈，SPF級，6～8周齡，體重18～20 g，雄性2只，雌性4只。SPF級雌性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重18～20 g，10只，購自廣東省醫學實驗動物中心[SCXK(粵)2008-0002]。小鼠飼養及操作均在廣東藥科大學實驗動物中心進行[SYXK(粵) 2012- 0125]，并嚴格遵守廣東藥科大學動物倫理的規定(福利倫理審查證：gdpulac2015014)。

1.2　細胞

B16F10黑色素瘤細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫，常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中。

1.3　實驗方法

1.3.1肺轉移小鼠模型建立

肺轉移小鼠模型根據文獻報道建立[5]，簡單概括為：把處于對數生長期的B16F10細胞用胰酶消化后，用無菌PBS調整細胞密度為1×105/mL，用臺盼藍染色確定活細胞數在95%以上，通過尾靜脈給每只小鼠注射0.2 mL(1×105個細胞)。B16F10細胞接種后21 d，安樂死處死小鼠，分離小鼠肺，在倒置顯微鏡下計數肺表面轉移腫瘤的數目。

1.3.2病理檢查

腫瘤組織石蠟包埋后，切片。將切片脫蠟至水，自來水清洗，用蘇木素染色，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇酸化后返藍，用伊紅染色，脫水用中性樹膠封片。在顯微鏡下計數轉移到肺組織中的結節數目。

1.4　統計學方法

2　結果

2.1　ANP敲除抑制了黑色素瘤B16F10細胞的肺轉移

注：與C57BL/6J小鼠比，*P < 0.05。圖1　ANP敲除對黑色素瘤的肺轉移的作用Note. Compared with the C57BL/6J mice，*P < 0.05.Fig.1　Effect of ANP deletion on the number of metastatic foci on the mouse lung surface

2.2　ANP敲除對肺組織中微轉移結節數目的影響

轉移模型建立后的第21天，處死小鼠，分離小鼠肺組織，固定、包埋、切片后，HE染色，C57BL/6J小鼠及ANP敲除小鼠的肺組織中都有黑色素瘤轉移結節(見圖2A和2B)，發現ANP敲除小鼠肺組織中微轉移結節的數目明顯比C57BL/6J少(見圖2C)。

3　討論

注：(A、B)C57BL/6J小鼠及ANP敲除小鼠肺組織的HE染色圖(Bar=500 μm)及局部轉移結節的放大圖(Bar=50 μm)；與C57BL/6J小鼠比較，***P< 0.001。圖2　ANP敲除顯著抑制了肺組織中微轉移結節數目Note. Compared with the C57BL/6J mice，***P < 0.001.Fig.2　Effect of ANP deletion on the number of micrometastatic foci in the mouse lung tissues revealed by histopathology. HE staining

心房鈉尿肽作為一種經典的血管活性肽，在腫瘤中的作用研究甚少。本研究利用ANP敲除小鼠和C57BL/6J小鼠，通過尾靜脈注射黑色素瘤B16F10細胞，建立黑色素瘤肺轉移瘤小鼠模型。利用ANP敲除小鼠研究黑色素瘤對肺轉移的作用，較其它模型具有一大優點：ANP基因的作用在小鼠中被完全消除，更能明確證實ANP基因在黑色素瘤肺轉移中的作用。本研究利用ANP敲除小鼠建立肺轉移模型，此模型具有腫瘤發生率高、容易建立、時間短、腫瘤轉移均一性好、個體差異小等優點。利用此小鼠模型，我們發現ANP敲除顯著抑制了黑色素瘤的肺轉移。但文獻報道用ANP治療DMBA (initiator)/croton oil誘導的小鼠皮膚癌，發現ANP通過激活NF-κB信號、肥大細胞及MMP2/9顯著抑制了皮膚癌的生長[6]。Takashi等[7]也報道ANP通過抑制肺癌A549細胞與內皮細胞粘附，進而抑制了腫瘤的肺轉移。這些研究與我們的研究結果相反，需要進一步探討。與我們研究不一致的原因可能如下：我們是利用ANP敲除小鼠研究ANP對黑色素瘤的肺轉移的作用，主要觀察ANP基因對腫瘤的作用，而Takashi等主要是用ANP蛋白治療腫瘤小鼠模型，研究ANP蛋白對腫瘤的作用，ANP在基因水平及蛋白水平對腫瘤的作用可能不一致。

綜上所述，ANP與黑色素瘤的肺轉移有著密切的關系，在黑色素瘤的肺轉移中發揮著正向調控的重要作用，但ANP對B16F10黑色素瘤細胞肺轉移的作用機制還不明確，需要進一步的探討。若進一步探討ANP對腫瘤的作用，可為判斷患者預后及尋找理想的抗腫瘤治療靶點提供重要的理論依據。

參考文獻：