VEGF調控Wnt/β-catenin信號通路對少突膠質前體細胞增殖遷移的影響

孟祥武，陳　娟，黃　淼，瞿昌華，鄭　龍

(湖北民族學院附屬民大醫院神經內科，湖北 恩施　445000)

少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)廣泛存在于中樞神經系統中，具有分化為星形膠質細胞和少突膠質細胞的潛能[1]。少突膠質前體細胞屬于神經膠質細胞，是除少突膠質細胞、小膠質細胞和星狀膠質細胞外的第四種神經膠質細胞[2]。少突膠質前體細胞與中樞神經系統的發育、修復、重建等都具有密切關系[3]。

血管內皮生長因子(VEGF)在脊椎動物的發育過程中發揮調節作用，參與胚胎神經發生及血管形成過程[4]。有研究表明，VEGF能夠促進小膠質細胞、星形膠質細胞和皮質神經元的增殖和遷移[5-6]。而VEGF對少突膠質前體細胞的增殖和遷移影響是否同其他神經膠質細胞一樣？本研究以少突膠質前體細胞為研究對象，探討血管內皮生長因子對少突膠質前體細胞增殖和遷移的影響，以期為治療中樞神經系統疾病提供新思路。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

12只出生24 h的SPF級C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體重8～10 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK(京)2015-0001]，飼養于湖北民院附屬民大醫院動物實驗中心[SYXK(鄂)2014-0035]，所有實驗流程均經動物倫理委員會通過(倫理審查證號：2015-0065)。

1.2　主要試劑及儀器

DMEM培養基、LiCl均購自于美國Sigma；VEGF購自于美國Peprotech；MMP-9單克隆抗體、MMP-2單克隆抗體、β-catenin單克隆抗體、C-myc單克隆抗體、cyclin D1單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物標記的二抗均購自于上海研卉生物科技有限公司；酶標儀、CO2培養箱購自于美國Thermo；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自于上海酶聯生物科技有限公司。

1.3　實驗方法

1.3.1少突膠質前體細胞分離及實驗分組

少突膠質前體細胞分離方法參照參考文獻[7]，取出生24 h的SPF級C57BL/6J小鼠，腹腔麻醉以后，無菌狀態下取其腦皮質，剪碎后，加入胰蛋白酶消化15 min，1000 r/min離心5 min，棄上清液。在沉淀中加含有20% FBS的DMEM細胞培養液混合后，過篩(70 μm細胞篩)，接種到多聚賴氨酸提前包被的細胞瓶中，放在37℃，5% CO2培養箱中培養，每隔72 h更換一次培養液，培養9 d后，將培養瓶放在振蕩器上震蕩1 h，棄細胞培養液，再加入10 mL新鮮的細胞培養液，放在振蕩器上震蕩1 h，收集上清液接種到細胞培養瓶中培養1 h。過篩(20 μm細胞篩)，吸取細胞懸浮液，1000 r/min，離心10 min，在細胞沉淀中加入細胞培養液混勻后，接種到細胞瓶中培養，分離培養的細胞特異性表達NG2，鑒定為少突膠質前體細胞。取少突膠質前體細胞，用100 ng/mL的VEGF作用于少突膠質前體細胞記為VEGF組，以加入0 ng/mL的VEGF處理后的少突膠質前體細胞記為對照組。

1.3.2MTT檢測細胞增殖

取出少突膠質前體細胞，用100 ng/mL的VEGF作用于少突膠質前體細胞記為VEGF組，每孔中加入100 μL的VEGF。每組設置8個復孔，同時設置空白組和對照組，空白組不加細胞，對照組中不加VEGF，其它步驟同VEGF組。放在37℃，5% CO2培養箱中培養48 h后，吸除孔內VEGF，每孔中加入50 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，放在37℃，5% CO2培養箱中孵育反應4 h。吸除細胞培養液，在細胞中加入DMSO溶液150 μL，震蕩反應10 min，待結晶物完全融化后，酶標儀檢測每孔的OD值，計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)

1.3.3Boyden chamber小室檢測細胞遷移

取少突膠質前體細胞，在多聚賴氨酸提前包被好的Boyden chamber小室的上室加入5×104個細胞，在小室的下室加入0 ng/mL、100 ng/mL的VEGF培養液，放在37℃，5% CO2培養箱中培養48 h后，用棉簽小心擦掉沒有穿過膜的少突膠質前體細胞。用甲醇固定穿膜的細胞20 min。用0.1%的結晶紫染色15 min后，加入PBS洗滌后，隨機選取6個視野對遷移的細胞計數，實驗重復三次。

1.3.4Western blot檢測細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平

少突膠質前體細胞與100 ng/mL的VEGF作用48 h后，在細胞中加裂解液，在冰上裂解20 min后，4℃，10 000 r/min離心15 min，吸取蛋白上清，BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白樣品濃度。蛋白樣品與loading buffer混合煮沸變性后，80 V電壓電泳30 min后，待溴酚藍到達濃縮膠和分離膠邊緣時，調整電壓至120 V繼續電泳。取出蛋白凝膠在300 mA，4℃轉膜90 min。經5%脫脂奶粉封閉后(37℃封閉2 h)。加入一抗(500倍稀釋)，室溫下孵育2 h，PBST洗滌后，加二抗(1000倍稀釋)孵育過夜。滴加DAB顯色液，暗室中曝光，以GAPDH為內參，分析蛋白表達水平。

1.3.5激活Wnt/β-catenin信號通路對細胞增殖遷移影響

少突膠質前體細胞與含有終濃度為20 μmol/L的Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用48 h后，記為激活劑組，以加入0 μmol/L的Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用48 h后的少突膠質前體細胞記為未處理組，檢測細胞增殖遷移情況，Western blot檢測細胞中MMP-9、MMP-2、β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平。

1.4　統計學方法

2　結果

2.1　少突膠質前體細胞形態

顯微鏡下觀察分離培養的少突膠質前體細胞呈圓形或者呈球形存在，多數聚集成塊狀，有典型的雙極或者三級突起。(圖1)

圖1　分離培養的少突膠質前體細胞(×200)Fig.1　Isolation and culture of the oligodendrocyte precursor cells

2.2　細胞增殖結果

少突膠質前體細胞與VEGF作用后，MTT檢測48 h的細胞存活率。結果顯示，VEGF組細胞存活率明顯高于對照組(P< 0.01)。(圖2)

注：與對照組比，**P< 0.01。圖2　VEGF對少突膠質前體細胞增殖影響結果Note. Compared with the control group,**P< 0.01.Fig.2　Effect of VEGF on the proliferation of the oligodendrocyte precursor cells

2.3　細胞遷移結果

少突膠質前體細胞與VEGF作用后，Boyden chamber小室檢測48 h細胞遷移情況。結果顯示，VEGF組細胞遷移數目明顯高于對照組(P< 0.01)。VEGF組細胞中遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯高于對照組(P< 0.01)。(圖3)

注：(A)遷移結果圖；(B)遷移細胞數目；(C)Western blot結果圖；(D)蛋白表達率；與對照組比，**P< 0.01。圖3　VEGF對少突膠質前體細胞遷移影響結果Note.(A)Migration results map.(B)The number of migrated cells.(C)Western blot results.(D)Protein expression rate. Compared with the control group，**P< 0.01.Fig.3　Effect of VEGF on the migration of oligodendrocyte precursor cells

2.4　VEGF對細胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結果

Western blot檢測了VEGF作用48 h后的少突膠質前體細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平。結果顯示，VEGF組細胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平均明顯高于對照組(P< 0.01)。(圖4)

注：(A)Western blot結果圖；(B)蛋白表達率；與對照組比，**P< 0.01。圖4　VEGF對β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結果Note.(A)Western blot results.(B)protein expression rate. Compared with the control group，**P< 0.01.Fig.4　Effect of VEGF on the expression of β-catenin，C-myc and cyclin D1

2.5　激活Wnt/β-catenin信號通路對細胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結果

收集Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用后的少突膠質前體細胞，Western blot檢測細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平。結果顯示，激活劑組細胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平明顯高于未處理組(P< 0.01)。(圖5)

注：(A)Western blot結果圖；(B)蛋白表達率；與未處理組比，**P< 0.01。圖5　激活Wnt/β-catenin信號通路對β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白表達影響結果Note.(A)Western blot results.(B)Protein expression rate. Compared with the untreated group，**P< 0.01.Fig.5　Effect of activation of Wnt/β-catenin signaling pathway on the expression of β-catenin，C-myc，and cyclin D1

2.6　激活Wnt/β-catenin信號通路對細胞增殖遷移影響結果

MTT檢測Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl作用后的少突膠質前體細胞48 h的細胞存活情況，Boyden chamber小室檢測48 h細胞遷移情況。結果顯示，激活劑組細胞存活率和遷移細胞數目均明顯高于未處理組，差異有顯著性(P< 0.01)。激活劑組細胞中遷移相關蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯高于未處理組，差異有顯著性(P< 0.01)。(圖6)

注：(A)細胞存活率；(B)遷移結果圖；(C)遷移細胞數；(D)Western blot結果圖；(E)蛋白表達率；與未處理組比，**P< 0.01。圖6　激活Wnt/β-catenin信號通路對細胞增殖遷移影響結果Note.(A)Cell survival rate.(B)Migration results map.(C)Number of migrated cells.(D)Western blot results.(E)Protein expression rate. Compared with the untreated group，**P< 0.01.Fig.6　Effect of activation of Wnt/β-catenin signaling pathway on the cell proliferation and migration

3　討論

少突膠質前體細胞在中樞神經系統疾病的發生過程中發揮重要作用[8]。少突膠質前體細胞能夠促進神經系統損傷修復及重建。中樞神經系統髓鞘的生長和少突膠質細胞密不可分，而髓鞘在中樞神經系統損傷修復中發揮積極作用[9-10]。有研究表明，在脫髓鞘病灶四周有許多少突膠質前體細胞存在，這些細胞是從室管膜的下區增殖遷移而來[11-12]。研究少突膠質細胞的增殖和遷移是研究中樞神經系統發育的重要組成部分。

VEGF相對分子量為34～45×103，編碼VEGF的基因約為14 kb，該基因含有7內含子和8個外顯子[13]。VEGF能夠促進血管生長，促進血管內皮細胞的分裂。近年來有研究表明，VEGF能夠促進神經元的延伸[14]。用VEGF作用于移植的腦皮層，組織中神經元延伸及神經元存活情況均明顯增加[15]。過表達小鼠體內的VEGF，神經干細胞增殖速度增加[16]。VEGF能夠在一定程度上逆轉缺氧對神經元的損害[17]。背根神經移植實驗證明，VEGF還具有促進雪旺細胞的增殖[18]。這些研究結果都表明，VEGF對神經系統具有一定的保護作用。除此之外還發現，VEGF能夠促進脊髓損傷小鼠膠質前體細胞的增殖和遷移，對星形膠質細胞的分裂也具有促進作用[19]。本研究中，通過體外分離培養小鼠少突膠質前體細胞，經VEGF作用后，發現細胞增殖和遷移能力均明顯增高。這提示，VEGF具有促進少突膠質前體細胞增殖和遷移的作用。

Wnt/β-catenin信號通路在細胞的生長過程中發揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路是一種高度保守的信號通路，在真核生物體內廣泛存在。β-連環蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信號通路中的效應因子，在信號轉導過程中起關鍵作用[20]。C-myc和cyclin D1是Wnt/β-catenin信號通路中的靶基因[21]。Wnt/β-catenin信號通路激活時，β-catenin、C-myc、cyclin D1表達增多[22]。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在中樞神經系統中具有保護作用，參與神經系統的發育[23]。VEGF能夠通過調控NOTCH、PI3K、ERK信號通路對少突膠質前體細胞的增殖和遷移發揮促進作用[24]。與NOTCH、PI3K、ERK信號通路一樣參與細胞生長的Wnt/β-catenin信號通路是否也與少突膠質前體細胞的增殖和遷移有關。本研究中，Western blot檢測了與VEGF作用后的少突膠質前體細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白的表達，結果發現，VEGF作用后的少突膠質前體細胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1蛋白水平表達上調。進一步用Wnt/β-catenin激活劑處理少突膠質前體細胞，發現細胞的增殖和遷移能力均明顯升高。

綜上所述，VEGF能夠促進少突膠質前體細胞的增殖和遷移，作用機制與Wnt/β-catenin信號通路有關。這為進一步研究中樞神經系統的組成奠定了基礎，為治療中樞神經系統疾病提供了新思路。