不同麻醉方法在大鼠腦室置管術中的效果及其對存活率的影響

楊亞南，舒　晴，陳　麗，周煥嬌，王雅媛，梁鳳霞*

(1.華潤武鋼總醫院中醫科，武漢　430080； 2.武漢大學中南醫院康復醫學科，武漢　430071； 3.湖北中醫藥大學，武漢　430061)

大鼠腦室置管是神經生物學常用的實驗手段，是進行中樞給藥或相關檢測的重要方式。相比微量注射器直接注射，腦室內置管后注射具有可延遲操作和可持續性干預的特點。由于腦室置管術需要應用腦立體定位儀固定大鼠，定位儀耳桿在固定大鼠的過程中會對大鼠的鼓膜產生強烈的刺激，同時腦室置管手術時間一般為40 min左右，故在手術過程中需要較強的麻醉深度及較長的麻醉時間。因此，合適的麻醉方式對腦室置管手術的成敗至關重要，也對置管術后大鼠的存活率及對相關生理指標有重要影響。筆者采用不同麻醉方式或藥物對大鼠行腦室置管術，觀察不同麻醉方式下腦室置管過程中及置管后大鼠的麻醉效果及存活率。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠，30只，體重(450±30)g，16周齡，由湖北省實驗動物中心提供[SCXK(鄂)2015-0018]。實驗操作在湖北中醫藥大學實驗動物中心針灸研究所[SYXK(鄂)2012-0068]進行，自由進食飲水，12 h明暗周期、動物房溫度(22±2)℃，相對溫度(50±10)%。每天更換墊料、飲水、清洗大鼠飲水器。動物處理及飼養條件按照實驗動物使用3R原則給予人道人關懷，并遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》和《實驗動物質量管理辦法》實施(倫理證號：2015[IEC]003號)。

1.2　主要試劑及儀器

水合氯醛(化學純，國藥集團，批號：20160113)；戊巴比妥鈉(分析純，德國默克公司，批號：20160411)；異氟烷(分析純，購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號：20160218)。

ZH-藍星B型腦立體定位儀(淮北正華)；異氟烷小動物麻醉系統(美國Harvard)；腦定位儀專用大鼠麻醉面罩、套管夾持器、顱鉆夾持器、麻醉誘導盒、顱鉆、直徑1.2 mm小螺釘(深圳瑞沃德)；玻璃離子水門汀(上海新世紀齒科)。

1.3　實驗方法

1.3.1動物分組

將30只大鼠適應性喂養1周，隨機分為3組：每組10只，參考文獻資料給藥標準[1-2]，分為水合氯醛組(濃度10%，按400 mg/kg給藥)、戊巴比妥鈉組(濃度2%，按40 mg/kg給藥)、異氟烷組(誘導濃度4%，維持濃度2%)。深度麻醉的表現為刺激雙后肢趾蹼、尾尖無反應、肌肉松馳、呼吸平順。實驗過程中，若出現大鼠四肢收縮、身體扭動等麻醉程度變淺的情況時，給予水合氯醛組和戊巴比妥鈉組大鼠立即添加維持量的麻醉藥物。整個實驗過程通過小動物加溫墊進行保溫。

1.3.2大鼠麻醉

腹腔注射：麻醉前禁食12 h，麻醉時左手拇、食、中指抓住大鼠頸部，固定大鼠頭部，小指和無名指抓住大鼠尾部。使其腹部向上，頭部朝下，內臟移向上腹部，右手持注射器以15°角刺入皮下約0.5 cm，再以45°度角刺穿腹部肌肉組織，將麻醉藥物一次性注入腹腔內。注射完成后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭防止漏液。

異氟烷氣體麻醉：將大鼠放入麻醉誘導盒，以4%的濃度導入異氟烷。待大鼠麻醉后，在腦立體定位儀上固定大鼠，利用麻醉呼吸面罩維持麻醉(濃度2%)，使其保持深度麻醉。

1.3.3第三腦室置管

將麻醉好的大鼠固定在大鼠腦立體定位儀上。備皮，用剪刀剪開皮膚、皮下組織，鈍性分離骨膜，暴露顱骨顯示前囟點，用無菌干棉球擦干凈局部。根據 George Paxinos 編寫的《The Rat Brain: in Stereotaxic Coordinates (6thedition)》[3]確定置管位置為第三腦室背側(D3V)將套管裝入夾持器，固定于腦立體定位儀上。將針尖移至前囟點，靠近骨面，讀取縱向刻度。將針尖往大鼠后方移動 0.16 cm即為第三腦室進針點，用筆做好標記。利用顱鉆在標記處鉆一個直徑約1 mm的小孔作為進針點，隨后在進針點前方及后方兩側共打3個孔，不要打穿顱骨，使三個孔成為一個等邊三角形。在3個孔中擰入直徑為1.2 mm的小螺絲，以固定牙科水泥。將套管針尖對準進針點，靠近顱骨骨面，讀取高度值。將套管高度下移 0.38 cm，針尖即進入第三腦室背側。保持夾持器的固定狀態，在導管周圍封上牙科水泥，并等待凝固后，松開夾持器。術后所有大鼠均單籠飼養，連續三天肌肉注射慶大霉素，劑量根據《藥理實驗方法學》中大鼠與人的劑量換算方法計算，為人臨床給藥劑量(mg/kg)的 6.3 倍[2]。

1.3.4手術前后體重、24 h進食量、血糖變化。

觀察各組大鼠腦室置管術前及術后1、3、7 d的體重及24 h進食量變化。檢測觀察各組大鼠麻醉前及麻醉中15、30 min，置管術后1、3、7 d的餐后血糖。血糖檢測采用尾尖采血，快速血糖儀檢測，分別在術前一天8:00 am，置管術中15、30 min及置管術后1、3、7 d的8:00 am進行檢測。

1.3.5麻醉效果的比較

麻醉起效時間：以注射麻藥或放入麻醉誘導盒至深度麻醉所需要時間，單位為分鐘。麻醉時間：以注射麻藥或放入麻醉誘導盒至完全清醒的時間，單位為分鐘。平均手術時間：以注射麻藥或放入麻醉誘導盒至手術結束的時間，單位為分鐘。術中不良反應率：術中出現呼吸抑制、死亡、大出血等。

1.3.6術后大鼠30 d生存率比較。

觀察并比較各組大鼠在行第三腦室置管術后30 d內的生存率，每日對各組大鼠的死亡情況進行計數并繪制生存曲線。

1.4　統計學方法

2　結果

2.1　不同麻醉方式對手術前后體重、24 h進食量及血糖的影響

體重：如圖1 A所示，三組大鼠在第3腦室置管手術前體重差異無顯著性(P> 0.05)。置管手術后1 d，三組大鼠體重與術前相比無明顯變化(P> 0.05)。置管術后3 d，水合氯醛組的大鼠體重較術前出現明顯降低(P< 0.05)，戊巴比妥鈉組和異氟烷組的體重較術前無顯著變化(P> 0.05)。置管術后第7天，水合氯醛組的大鼠體重較術前出現明顯的大幅降低(P< 0.01)，戊巴比妥鈉組體重較術前無顯著性變化，異氟烷組較術前體重出現上升(P< 0.05)。

進食量：如圖1B所示，三組大鼠在第3腦室置管手術前進食量差異無顯著性(P> 0.05)。置管手術后1 d，水合氯醛組和戊巴比妥鈉組大鼠的進食量較術前出現明顯下降(P< 0.01)，異氟烷組大鼠的進食量較手術前一天無顯著變化(P> 0.05)，組間比較發現異氟烷組進食量顯著高于水合氯醛組和戊巴比妥鈉組(P< 0.01)。置管術后3 d，水合氯醛組大鼠的進食量出現大幅度下降，顯著低于術前和術后1 d(P< 0.01)。戊巴比妥鈉組大鼠進食量雖然仍低于術前(P< 0.01)，但高于術后1 d(P< 0.05)。異氟烷組大鼠進食量與術前差異無顯著性(P> 0.05)，但高于術后1 d(P< 0.05)。置管術后7 d，水合氯醛組大鼠的進食量再次較術前3 d出現顯著下降，平均24 h進食量僅3.0 g，戊巴比妥鈉組大鼠進食量較術后3 d上升(P> 0.05)，但仍低于手術前(P< 0.01)。異氟烷組大鼠進食量與術前及術后3 d差異無顯著性(P> 0.05)。

注：與手術前(0天)相比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖1　不同麻醉方法對腦室置管手術前后體重、進食量的影響Note. Compared with that before operation，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.1　Effects of different anesthesia methods on body mass and food intake in the rats before and after intraventricular catheterization

血糖：如圖2所示，三組大鼠血糖差異無顯著性(P> 0.05)。麻醉15 min后，三組大鼠血糖均較麻醉前增高(P< 0.01)。組間比較發現，水合氯醛組上升幅度顯著高于戊巴比妥鈉組和異氟烷組(P< 0.01)。麻醉30 min后，三組大鼠血糖均明顯高于麻醉前(P< 0.01)，與麻醉15 min血糖水平差異無顯著性(P> 0.05)。組間比較發現，水合氯醛組上升幅度仍顯著高于戊巴比妥鈉組和異氟烷組(P< 0.01)。術后1 d，水合氯醛組血糖較術前下降(P< 0.05)，戊巴比妥鈉組與異氟烷組較術前差異無顯著性(P> 0.05)。術后3 d，水合氯醛組血糖呈繼續下降趨勢，平均血糖值3.2 mmol/L，低于術前及術后1 d(P< 0.01)，戊巴比妥鈉組與異氟烷組較術前及術后1 d差異無顯著性(P> 0.05)。術后7 d，水合氯醛組血糖繼續下降，平均血糖值僅2.6 mmol/L，低于術前及術后1、3 d(P< 0.01)，戊巴比妥鈉組與異氟烷組較術前及術后1 d差異無顯著性(P> 0.05)。術后14 d，水合氯醛組的血糖值繼續保持在較低水平，且僅有4只大鼠存活, 戊巴比妥鈉組與異氟烷組較術前及術后1 d差異無顯著性(P> 0.05)。術后28 d，水合氯醛組大鼠全部死亡，無法統計血糖值

注：與手術前(0天)相比，*P< 0.05，**P< 0.01.圖2　不同麻醉方法在不同時間段血糖水平變化Note. Compared with that before operation，*P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2　Changes of blood glucose levels in the rats at different periods after different anesthesia procedures

2.2　各組大鼠麻醉效果的比較

麻醉起效時間：如圖3 A所示，水合氯醛組平均麻醉起效時間為(6.2±1.2)min，戊巴比妥鈉組為(11.9±1.5)min，異氟烷組為(3.1±0.6)min。異氟烷組顯著低于水合氯醛組(P< 0.01)，水合氯醛組顯著低于戊巴比妥鈉組(P< 0.01)。

注：(a)水合氯醛組；(b)戊巴比妥鈉組；(c)異氟烷組；與水合氯醛組比，#P< 0.01。圖3　不同麻醉方法對腦室置管大鼠麻醉效果比較Note.(a)Chloral hydrate group.(b)Pentobarbital sodium group.(c)Isoflurane group. Compared with the chloral hydrate group，#P< 0.01.Fig.3　Effectiveness of different anesthesia methods on the ventricular catheterization in rats

圖4　各組大鼠生存曲線Fig.4　Survival curves of the rats in each group.

麻醉時間：如圖3B所示，水合氯醛組平均麻醉時間為(106.6±5.2)min，戊巴比妥鈉組為(123.4±8.8)min，異氟烷組為(41.2±1.6)min。異氟烷組麻醉時間顯著低于水合氯醛組(P< 0.01)，水合氯醛組低于戊巴比妥鈉組(P< 0.01)。

手術時間：如圖3C所示，水合氯醛組平均手術時間為(45.9±4.3)min，戊巴比妥鈉組為(57.4±7.7)min，異氟烷組為(37.9±1.9)min。異氟烷組手術時間顯著低于水合氯醛組(P< 0.01)，水合氯醛組低于戊巴比妥鈉組(P< 0.01)。

2.3　各組大鼠生存情況比較

如圖4所示，水合氯醛組大鼠分別在手術后2、4、7、10、15、18、24 d出現大鼠的死亡，截止術后30 d，該組大鼠全部死亡。戊巴比妥鈉組大鼠在麻醉過程中出現3只死亡，在術后26 d出現1只死亡，截止術后30 d，該組大鼠合計存活6只。異氟烷組在手術過程及整個30 d內未出現死亡。

2.4　不良反應及死亡原因

水合氯醛組大鼠在術中麻醉深度適度，未出現明顯不良反應，術后大鼠出現腹部進行性膨大，死亡后解剖大鼠發現大鼠腸管梗阻，梗阻腸管以上節段嚴重擴張，結果大鼠后期出現進食量、血糖值、體重均出現明顯下降，考慮因腸梗阻導致的無法進食，血糖降低，最終死亡。戊巴比妥鈉組大鼠在腹部注射麻藥后，進入深度麻醉的時間較長，有大鼠出現無法進入深度麻醉，補充注射后出現呼吸急促等不良反應，麻醉過程中共有3只大鼠出現死亡。該組大鼠術后26 d時出現一例死亡，解剖后未見明顯腸管擴張，拆除頭部套管后，發現套管下方有膿性分泌物，考慮死亡原因可能與感染有關。

3　討論

水合氯醛、戊巴比妥鈉、異氟烷均是實驗室常用的動物麻醉藥物，在動物的各型手術中有著廣泛的應用。部分動物手術的創傷較大，甚至在術后體內會留有內置物。所以麻醉效果及術后恢復的好壞對此類動物實驗的成功有著重要的影響。第3腦室在能量代謝中樞-下丘腦的中心部位，第3腦室置管及注射是一種重要中樞干預手段，在神經-內分泌-代謝的相關研究中具有不可或缺的地位。由于內分泌疾病如肥胖、糖尿病的發病過程及干預過程均較為緩慢，屬于慢性動物實驗研究的范疇，故若需要進行長期的中樞干預，則需要在第3腦室進行置管后再進行注射，以維持干預效應。故在不影響大鼠代謝的情況下保持其長時間的存活顯得尤為重要。

水合氯醛是動物實驗中應用廣泛的一種麻醉劑，常采用腹腔注射的方式進行麻醉，具有麻醉速度快，作用持久的特點，但其對心肌收縮力具有一定的抑制作用[4-5]，對心血管系統影響明顯，不適合用于心血管病的實驗動物研究[6]。從本實驗的結果看，大鼠接受水合氯醛腹腔注射麻醉后，能夠很快進入深度麻醉狀態，大鼠對腦室置管過程中耳桿夾持這種重刺激無反應，能夠保證置管手術的順利進行，手術時間合理。根據現在文獻報道[7]，低濃度水合氯醛的濃度麻醉開始時間和持續時間均低于高濃度。預實驗過程中發現，由于腦室置管手術過程中需要進行耳桿固定和顱骨鉆孔，刺激強度明顯大于普通手術，應用300 mg/kg的麻醉劑量無法保持大鼠的深度麻醉，為保證手術的正常進行，選取400 mg/kg的劑量進行腹腔麻醉。考慮到大鼠進行水合氯醛腹腔麻醉的半數致死量(LD50)為480 mg/kg,本實驗過程使用的400 mg/kg與LD50的注射劑量接，尚不能完全排除水合氯醛組的高死亡率與劑量具有相關性。大鼠在腹腔注射水合氯醛后血糖明顯升高，雖然在術后1 d時血糖恢復，但術后大鼠持續食欲下降，體重減輕、術后3～7 d出現嚴重低血糖，并陸續有大鼠死亡。解剖后發現死亡大鼠均有不同程度的腸麻痹，導致食物傳輸受阻、不能進食，出現嚴重低血糖，最終導致死亡。水合氯醛腹腔注射導致腸麻痹的不良反應早在上世紀90年代就有報道[8]，特別在腦部手術中表現得更為明顯[9]，腸麻痹的發生率約為50%。還有研究顯示，水合氯醛腹腔注射麻醉會導致腹腔黏連及單側睪丸攣縮，說明這種麻醉方式也不適合男性病的動物實驗模型[10]。本實驗結果顯示，大鼠在30 d內全部死亡，麻痹的發生率為100%。明顯高于之前的文獻報道，可能與頭部手術的創傷程度有關。

戊巴比妥鈉因其給藥方式簡單，起效較快、麻醉時間長等特點成為實驗動物麻醉的常用藥物，但該藥會對呼吸中樞有較強的抑制作用，注射的安全范圍小，麻醉深度不易掌握，麻醉過程中易出現喉和支氣管痙攣而導致動物死亡[11-12]。從本實驗的結果分析發現，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉的起效時間明顯長于水合氯醛組和異氟烷組，大鼠麻醉的成功率較低，麻醉深度不夠，在夾持耳桿時會出現身體扭動，不利于手術的進行。因其麻醉劑量安全范圍小，補充麻醉后出現3例大鼠因呼吸抑制而死亡。由于麻醉誘導時間過長，麻醉深度欠佳，所以手術時間和麻醉時間均是三組中最長的。麻醉過程中血糖雖有短時的小幅上升，但在術后及術后一周內均保持穩定。術后1 d的大鼠進食量較術前下降，在一周內恢復至正常水平。最終，該組大鼠在30 d的觀察期內共存活6只，主要的死亡原因是麻醉過量。

異氟烷是目前較為常用的吸入性麻醉劑，具有麻醉誘導快、可隨時調節和控制麻醉深度、麻醉后恢復迅速、毒性低等優點[13]。研究顯示異氟烷麻醉能夠對實驗動物的心血管和神經系統有一定的保護作用[14]，主要表現為對心肌、腦缺血再灌注的保護作用[15-16]，同時還對肝臟及肺缺血具有一定的保護作用[17-18]。在小動物的MRI檢查中，異氟烷吸入麻醉可以更好的控制動物呼吸，保證動物安全，提高成像質量[19]。本實驗結果顯示，異氟烷誘導麻醉的時間最短，手術過程中，大鼠對耳桿的夾持無反應，麻醉深度好，手術時間短，麻醉后血糖雖有小幅升高，但升高幅度明顯低于水合氯醛組。術后1 d血糖及進食量即恢復至術前水平。術后大鼠進食量穩定，體重保持平穩增長，30 d觀察期內無大鼠死亡。

綜上所述，水合氯醛雖然麻醉誘導時間短，麻醉深度可，但其術后易極發生腸麻痹，導致大鼠進食減少、體重下降、血糖下降，故不適用于腦室置管手術。戊巴比妥鈉麻醉誘導時間較長，麻醉深度欠佳，安全范圍低，麻醉過程中易發生大鼠死亡，但術后無腸麻痹這種嚴重不良反應，手術成功后仍能保證大鼠有較高的存活率，在掌握好麻醉劑量的情況下，可以在腦室置管手術中應用。異氟烷吸入麻醉誘導時間快，麻醉深度好，麻醉時間及深度均可控，術后大鼠進食量、血糖穩定，體重保持增長，無腸麻痹等不良反應，但由于異氟烷吸入麻醉機價格較高，在有條件的情況下值得在大鼠腦室置管手術中推薦使用。