納米銀對水體中硝化細菌活性的影響

陳姝穎，李海毅，李昭陽

(吉林大學環境與資源學院，吉林 長春 130012)

隨著納米技術的快速發展，納米材料已廣泛應用到工業、農業和畜牧養殖業等領域，進入環境中的納米材料逐年增加，同時也不可避免地進入到水體中，[1]特別是銀納米粒子，一種常用的抗菌性納米粒子.在眾多抗菌材料中，無機含銀納米抗菌材料具有較廣的抗菌范圍，殺菌能力很強并且對環境的毒性效應較低，是目前使用范圍最大的抗菌材料之一[2].然而隨著納米銀的大量使用，其在環境中的影響和作用機制也引起了學者的廣泛關注[3-5].

以往，研究人員對納米銀(AgNPs)進行了許多的體外毒性實驗及其毒性作用機制的探討.有研究[6-7]表明，納米銀包被材料的種類和直徑大小可能對其毒害效果產生影響；針對不一樣的細胞類型，例如對放線菌、細菌、真菌，其毒害效果也有所差異.B?hmert等[8]發現納米銀會產生活性氧和超氧陰離子，這些活性物質可以氧化細胞膜和脂質導致生物體細胞的受損和死亡.納米銀的毒性作用與納米顆粒的粒徑大小有關，Choi等[9]發現納米銀的粒徑小于5 nm 時對細菌的毒性最強.硝化細菌在自然環境的氮循環中發揮著重要作用，而在水生態系統中由于納米銀的進入對硝化細菌產生的影響情況還知之甚少，所以本文研究了在不同AgNPs濃度、pH和天然有機質的條件下，納米銀對水體中硝化細菌的影響，以為水環境中納米銀的毒性效應研究提供一定的理論依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

納米銀(AgNPs，1 mg/mL，粒徑≤15 nm)購自廣州艾普納米科技有限公司；硝化細菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心.實驗用水為實驗室配水，供試水體的基本性質見表1.

表1 供試水體基本性質

1.2 實驗方法

將細菌樣品分散到配制的供試水體中，混勻后逐級稀釋至適當倍數.取100 μL稀釋液涂布于斯蒂芬遜培養基平板上，恒溫(25℃)恒濕培養，通過菌落數和稀釋倍數計算出實際菌量.所有實驗設置3個平行，每個平行2次重復.

抑菌率(%)=100×(空白對照組菌量-處理組菌量)/空白對照組菌量.

1.3 數據處理與分析

實驗數據統計分析和圖表制作采用 IBM SPSS Statistics 19，Microsoft Office Excel 2010和OriginPro8.SR3軟件.

2 結果與討論

2.1 不同質量濃度的納米銀對硝化細菌活性的影響

將一定量硝化細菌加入到AgNPs質量濃度分別為0，5，10，15和20 μg/mL的1 mL水體中，混勻后分別取出100 μL在培養基上進行培養，培養溫度為25℃，pH=7.2.在培養的第0，2，4，6，8和10天分別計數.AgNPs對硝化細菌活性的影響結果見圖1.

由圖1可見，整個實驗期間未添加AgNPs水體的空白對照組硝化細菌的數量均高于添加組，且差異均顯著；AgNPs質量濃度為0和5 μg/mL的兩個處理組隨著處理時間的增加硝化細菌的數量先增加后降低，這是由于土壤中一開始有可供應硝化細菌生長繁殖的營養物質，隨著硝化細菌的增加，營養物質減少，細菌產生了競爭和饑餓導致數量減少.AgNPs質量濃度為10，15，20 μg/mL的3個處理組，硝化細菌的數量呈先下降、后上升、再下降的變化趨勢，產生這種現象的原因可能是由于最初AgNPs的質量濃度較高，對硝化細菌的毒性較大，進而導致硝化細菌死亡；隨后硝化細菌產生抗性并進行繁殖，數量有所回升；而后期營養物質減少又導致數量再次下降.由此可知，AgNPs對硝化細菌有一定的抑制作用.AgNPs與生物分子相似而且粒徑細小，很容易被生物攝入細胞內，破壞細胞結構，擾亂細胞的正常代謝循環；同時，也可以溶解出相應的金屬離子，造成一定的毒性.AgNPs對硝化細菌活性的抑制情況見圖2.

圖1 不同濃度AgNPs對硝化細菌的影響

由圖2可見，硝化細菌的抑制率隨添加的AgNPs質量濃度的增加而增大.AgNPs質量濃度為20 μg/mL時，在第2天硝化細菌的抑制率就達到了95%，在第10天達到了98%；AgNPs為5 μg/mL時，硝化細菌的抑制率在第4天才達到最大，為32.74%.所以高濃度和低濃度的AgNPs都會對硝化細菌造成一定的抑制作用.從圖2還可以看出，AgNPs質量濃度為15和20 μg/mL時抑制率先增加然后逐漸達到平穩，說明硝化細菌對高濃度的AgNPs抵制能力較弱，進而很快受了抑制；而在AgNPs質量濃度為5和10 μg/mL時，硝化細菌的抑制率都是先增加后降低然后再增加，說明低濃度的AgNPs，對硝化細菌一開始有一定的抑制作用，但隨著時間增加硝化細菌產生了抗性，進而繼續生長繁殖數量增多，到后期在AgNPs和營養物質減少的雙重作用下，細菌數量再一次降低，進而導致抑制率又上升.謝小保等[10]研究了納米銀粒子對大腸桿菌細胞的影響機制發現，納米銀粒子通過破壞細胞壁產生孔洞后進入周質空間，導致細胞膜成分滲漏，在破壞細胞膜的同時進入細胞內部，對細胞造成損傷；Kim等[11]研究了納米銀對白色念珠菌的作用，也發現了納米銀會進入細胞內部并對細胞內的DNA和細胞質造成傷害，導致細菌最終死亡.還有學者[12]研究了納米銀對大腸桿菌的影響，發現納米銀濃度會影響大腸桿菌細胞內脫氫酶的活性，并且隨著納米銀濃度的增高而降低.Abbasi等[13]的研究表明，納米銀產生的活性氧既可以直接對細菌產生強氧化作用使細胞死亡，同時活性氧還可以對呼吸酶產生一定的抑制作用，間接導致細菌死亡.

2.2 納米銀對不同pH水體硝化細菌活性的影響

水體的pH是影響水體中微生物活動的重要理化性質之一，pH過高或過低都會對微生物的活性產生影響.而pH對AgNPs的環境行為也有一定的影響.將細菌分別加入到pH為3，5，7，9和11的AgNPs質量濃度均為10 μg/mL的水樣中，混勻后取出100 μL進行培養.培養溫度為25℃.在培養的第0，2，4，6，8和10天分別進行計數，結果見圖3.不添加AgNPs時，pH對硝化細菌也有一定的抑制作用，抑制情況如圖4所示.

圖3 AgNPs對不同pH水體硝化細菌活性的抑制率

由圖3可見，低pH值條件下AgNPs對硝化細菌的抑制率較強，而在高pH值條件下AgNPs對硝化細菌的抑制率有所減弱.在pH=3和pH=5時，抑制率在第6天達到最大，分別為96.97%和93.86%；而pH=11時，抑制率先上升再降低，在第6天達到最大為60.48%，而在第10天降到54.83%.由圖4可見，不同的pH對硝化細菌也有一定的影響.當pH=7時，對硝化細菌先有一定的抑制作用，而隨著時間的增加對硝化細菌的生長繁殖有一定的促進作用，但變化波動范圍不大，在0.05%左右波動；而其他pH條件對硝化細菌也有一定的抑制作用，但是抑制率均在10%以內，pH=3時，抑制率在第2天為7.84%，之后趨于平緩.所以綜上可以看出抑制硝化細菌的主要因素不是pH.

有研究[14]表明，低pH值條件下金屬納米顆粒易于金屬離子釋放，而高pH值條件則容易發生團聚.在pH值較低時，AgNPs釋放大量的Ag+，較高濃度的Ag+會與細菌相互作用，對硝化細菌細胞產生毒性和脅迫導致細胞破裂和死亡，而Ag+和AgNPs的復合作用導致對細菌的毒性加強；pH值較高時，由于AgNPs發生團聚，降低了AgNPs與細菌接觸的概率，毒性作用減弱，從而導致硝化細菌抑制率降低.

圖5 水中添加腐殖酸AgNPs對硝化細菌活性的抑制率

2.3 納米銀對腐殖酸水體中硝化細菌活性的影響

天然有機質是水體和土壤環境中植物或微生物殘骸經過一定的生物過程而廣泛存在的一類復雜的有機物質[15].有研究表明，自然環境中存在的天然有機質會影響納米顆粒物在環境中的行為[16].在pH=7.2，AgNPs質量濃度為10 μg/mL條件下，細菌培養溫度為25℃時，本實驗研究了腐殖酸的存在是否影響AgNPs對水體硝化細菌的抑制作用，結果見圖5.體系中腐殖酸的濃度固定為50 mmol/L(以C計).

由圖5可見，水體中添加腐殖酸明顯降低了AgNPs對硝化細菌的抑制作用，隨著培養時間的增加硝化細菌的抑制率先增加，在第4天抑制率達到最高，為13.38%；隨后抑制率降低，第10天的抑制率僅為6.35%.由此可以看出，環境中廣泛存在的天然有機質腐殖酸能夠影響納米顆粒物對水體中微生物的毒害作用.有研究[17]表明，納米顆粒物的表面電荷會受到天然有機質的影響，天然有機質可以增強納米顆粒物膠體的熱穩定性以及提供靜電斥力和空間位阻穩定納米顆粒物膠體，從而可以使納米顆粒物在水體環境中產生的團聚現象趨于穩定，并且降低納米顆粒物對水體中生物的毒性.還有研究[18]發現，納米顆粒物的表面包被了天然有機質，在水環境中減少了納米顆粒和生物的接觸概率，相應降低了納米顆粒對水體生物的毒害作用.

3 結論

本實驗研究結果表明，AgNPs在質量濃度0～20 μg/mL范圍內均對硝化細菌有抑制作用，且濃度越高抑制率越高.低pH值條件下AgNPs易于金屬離子釋放，對硝化細菌的抑制率較高；而高pH值條件下AgNPs容易發生團聚，對硝化細菌的毒性作用減弱.腐殖酸能夠促使水體中AgNPs的團聚趨于穩定，并且還能夠包覆AgNPs降低對硝化細菌的毒性作用.

[參 考 文 獻]

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