酶促反應(yīng)循環(huán)煙酰胺型輔酶研究進展

鄭遠迪 惠秀娟

煙酰胺型輔酶作為最為常見的一種輔酶，參與到多種生物體的氧化還原反應(yīng)中。在體外酶反應(yīng)的過程中，輔酶的需求量很高，為了節(jié)省成本，輔酶循環(huán)路徑成為了眾多研究的焦點，本文選取近年來在這方面的研究進展進行總結(jié)。

1 介紹

輔酶是一種可以與酶蛋白松散結(jié)合的有機小分子，對于促進特定酶反應(yīng)的過程有十分重要的意義。輔酶Ⅰ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）與輔酶Ⅱ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）均為重要的核苷酸類輔酶。煙酰胺型輔酶NAD（P）H作為氧化劑或還原劑直接參與到含有氧化還原酶的酶促反應(yīng)中，加快了反應(yīng)速率。

但煙酰胺型輔酶NAD（P）H價格昂貴，輔酶成本往往大于產(chǎn)物收益，因此如何將輔酶進行循環(huán)利用是十分重要的課題。NAD+和NADP+為氧化態(tài)， NADH、NADPH為還原態(tài)， 煙酰胺性輔酶循環(huán)再生的基本原理為氧化態(tài)輔酶和還原態(tài)輔酶通過加氫或脫氫的氧化還原反應(yīng)相互轉(zhuǎn)化。

輔酶循環(huán)研究目前有酶法，電化學(xué)法，光化學(xué)法等多種方法。根據(jù)分離難易程度，反應(yīng)動力學(xué)以及反應(yīng)成本等多方面考慮，在反應(yīng)體系中構(gòu)建多酶催化從而實現(xiàn)輔酶循環(huán)再生的方法最為經(jīng)濟實惠。

2 煙酰胺型輔酶循環(huán)

2.1 NAD+與NADH循環(huán)

NAD+參與的氧化還原反應(yīng)中，起到電子和氫傳遞作用的主要是分子中的煙酰胺單核苷酸（NMN），可結(jié)合的酶種類較多，研究意義重大。

Francesco G. Mutti，等人在通過雙酶氫借用級聯(lián)將醇轉(zhuǎn)化為對映體純的胺的實驗中， 選擇了一種高度對映選擇性催化氫化的伯和仲醇，只需要兩個生物催化劑，即ADH和胺脫氫酶（AmDH）。氧化還原自足循環(huán)使用銨離子/氨作為氮源并僅產(chǎn)生水作為副產(chǎn)物。級聯(lián)僅需要催化量的煙酰胺輔酶，其將氫化物從氧化步驟轉(zhuǎn)移到還原步驟。該方法已成功地應(yīng)用于具有反轉(zhuǎn)構(gòu)型的光學(xué)活性仲醇的胺化，并且在第一步與第二步反應(yīng)中間實現(xiàn)了輔酶循環(huán)。

多酶反應(yīng)步驟復(fù)雜，不局限于一組輔酶循環(huán)。Rongsheng Tao 通過由L-蘇氨酸脫氨酶催化的脫氨基后續(xù)氫化反應(yīng)進行L-2-氨基丁酸的生物合成，然后由L-蘇氨酸由L-蘇氨酸與甲酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶作為NADH再生系統(tǒng)催化的氫化反應(yīng)。劉珊等人在合成L-2-丁酸的研究中，就在一鍋反應(yīng)的體系中用到了酮還原酶作為輔酶循環(huán)體系的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物易分離，降低分離成本跟時間。

全細胞催化反應(yīng)中，也會設(shè)計加入輔酶循環(huán)系統(tǒng)來完成復(fù)雜轉(zhuǎn)化。W. Brian Whitaker構(gòu)建重組大腸桿菌，使其可以利用甲醇作為碳源，轉(zhuǎn)化生成生物量成分和高價值特種化學(xué)品。該研究中并未組成完整的閉合環(huán)路來循環(huán)輔酶，而是在多個酶促反應(yīng)中，構(gòu)建多個輔酶利用途徑，從而達到整體輔酶總量的循環(huán)。全細胞催化反應(yīng)不僅反應(yīng)穩(wěn)定，而且輔酶跟酶可以附著在細胞器上達到最大利用效率。

固定化酶技術(shù)也可用于輔酶循環(huán)研究。Jinglin Fu 設(shè)計和構(gòu)建人工搖擺通道多酶復(fù)合物與NAD +修飾的分子臂，以轉(zhuǎn)移兩個脫氫酶之間的氫化物。搖擺臂不僅顯著增強酶活性，而且在復(fù)雜環(huán)境中提供高特異性。輔酶因子距離擺動臂的距離以及游離度對整個反應(yīng)進程都有著影響。Muqing Zheng， Zhiguo Su 將谷氨酸脫氫酶（GluDH），葡萄糖脫氫酶（GDH）和輔因子NAD（H）的多酶系統(tǒng)固定在磁性納米顆粒上，在外加磁場中能提高輔酶循環(huán)效率和酶穩(wěn)定性。

2.2 NADP+與NADPH循環(huán)

相比于NAD（H），NADP（H）的價格更為昂貴，如果能夠?qū)崿F(xiàn)高效的循環(huán)再生，則能顯著提高反應(yīng)的經(jīng)濟效益。由于NAP（H）的應(yīng)用廣泛程度不如NAD（H），因此研究進展相對較少。

茅佳靈和許琳研究乳酸合成體外代謝途徑時，構(gòu)建了輔酶ⅡNADP+與NADPH循環(huán)。利用反應(yīng)體系中的乳酸脫氫酶和非磷酸化的3-磷酸甘油醛脫氫酶兩條路線中的酶反應(yīng)來實現(xiàn)NADP（H）的循環(huán)。并且實驗得出結(jié)論提高反應(yīng)體系中NADP+ 初始濃度有利于提高乳酸的產(chǎn)率。

Alexander Dennig 等人研究單取代苯在與三種同時酶的一鍋反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為對映純的L-酪氨酸衍生物反應(yīng)。這第一步反應(yīng)是苯首先通過工程化的P450合酶羥基化。第二部反應(yīng)中工程化酪氨酸苯酚裂解酶催化C-C-偶聯(lián)反應(yīng)，隨后用丙酮酸和氨作為共底物的酚的不對稱胺化。NADPH輔因子再循環(huán)與葡萄糖脫氫酶同時進行。

有的反應(yīng)關(guān)鍵酶就需要用到輔酶促進反應(yīng)，可在反應(yīng)中引入第二種酶進行循環(huán)反應(yīng)。Gao， C.Zhang， L的研究構(gòu)建了由來自氧化葡糖桿菌的NADPH依賴性羰基還原酶（Gox0644）和葡萄糖脫氫酶（GDH）組成的雙酶循環(huán)系統(tǒng)，更高效的生產(chǎn)了具有經(jīng)濟價值的手性化學(xué)品（3S）-乙酰膽堿。

輔酶在酶促反應(yīng)中起著不可忽視的作用，甚至決定了整個反應(yīng)的引發(fā)和走向。在酶促反應(yīng)中加入其它酶從而達成輔酶循環(huán)目的，既能調(diào)節(jié)反應(yīng)平衡，達到最大產(chǎn)率，又能降低成本提高經(jīng)濟效益。但由于多酶反應(yīng)體系復(fù)雜，選取合適的酶構(gòu)建循環(huán)系統(tǒng)成為了今后研究的重點難點。

（作者單位：110000遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院）