番石榴葉抑制db/db小鼠腎臟TGF-β1蛋白表達(dá)研究*

段 穎，郭翔宇，劉銅華，孫 文，許光遠(yuǎn)，董笑克，丁 雷

1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)科 (北京 100730)，2．北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科(北京 100078)，3．北京中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生研究所(北京 100029)，4．首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院中醫(yī)科(北京 100038)，5．北京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(北京100078)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，DN早期癥狀比較隱匿，隨著病情進(jìn)展出現(xiàn)進(jìn)行性蛋白尿和腎功能減退[1]，后期發(fā)展為終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)，是糖尿病患者致殘、致死的主要原因之一[2]。DN早期病理改變表現(xiàn)為基底膜輕度增厚及系膜基質(zhì)增生，腎小球?yàn)V過(guò)率升高和腎小球肥大，后期形成典型的Kimmelstiel-Wilson 結(jié)節(jié)，腎小球?yàn)V過(guò)率進(jìn)行性下降[3]。前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)番石榴葉提取物可以降低血糖，改善胰島素抵抗[4-5]。但番石榴葉是否有腎臟保護(hù)并不清楚。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步觀察番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠腎臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)的影響，探討番石榴葉改善腎臟纖維化的作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)藥物 番石榴葉干燥葉片購(gòu)自沈陽(yáng)醫(yī)藥集團(tuán)公司大東公司，由北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提取，提取工藝為：番石榴葉片粉碎后取粗粉1.1kg，用3倍量乙酸乙酯在25℃、超聲50MHz的條件下提取10 min，重復(fù)共7次，過(guò)濾取藥渣，用5倍量的乙醇超聲提取15min/次，重復(fù)4次，留取過(guò)濾液，濃縮得浸膏。浸膏與4倍量水制成混懸液，6000 r/min條件下離心15min得上清液1；乙醇提取剩余藥渣用5倍量水超聲提取40min，重復(fù)2次，將兩次過(guò)濾所得濾液合并，在6000 r/min的條件下離心15min得上清液2，合并上清液1、2，采用改良明膠法去除鞣質(zhì)，再次過(guò)濾后濾液上聚酰胺(100～200 目)柱，依次用水洗脫，洗脫液減壓濃縮，制得水浸膏64.07 g。

2 動(dòng)物與飼養(yǎng) 16只10周齡SPF級(jí)雄性C57BLKS/J db/db小鼠，8只C57BLKS/J db/m同窩小鼠作為對(duì)照，所有動(dòng)物均由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。動(dòng)物在北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SPF級(jí))飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃、濕度(55±10) %，12/12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水，db/db小鼠予高脂飼料(購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司)喂養(yǎng)，db/m小鼠喂養(yǎng)小鼠全價(jià)營(yíng)養(yǎng)普通飼料(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，除實(shí)驗(yàn)需要空腹禁食外，其余時(shí)間小鼠均自由進(jìn)食、飲水。

3 試劑與儀器 瑞士羅氏血糖儀及配套試紙；HE試劑盒，北京索萊寶生物科技公司；(30)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG，中杉金橋公司；羊抗兔IgG/HRP，美國(guó)Sigma公司；TGF-β1抗體，美國(guó)CST公司；低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；BX53型光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司。

4 分組與給藥 所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，根據(jù)小鼠體重、血糖，將db/db小鼠采用區(qū)組隨機(jī)法分為番石榴葉提物組和模型組，db/m小鼠設(shè)為正常對(duì)照組，每組各8只。分組完成后按體表面積換算法分別給藥，各組劑量為：番石榴葉提物組 0.11g/(kg·d-1)(相當(dāng)于生藥材2g/kg)；正常組、模型組每日灌服等量蒸餾水；每日固定時(shí)間灌胃1次，連續(xù)12周。

5 標(biāo)本采集 干預(yù)12周后，所有小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血，離心分離血清-80℃凍存待用；頸椎脫臼法處死，迅速剖取小鼠左側(cè)腎臟，固定于4%多聚甲醛中待用。

6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

6.1 觀察小鼠一般情況:觀察并記錄實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛色、進(jìn)食量、飲水量一般情況等，每4周記錄一次體重變化。

6.2 血糖測(cè)定:分別檢測(cè)各組大鼠入組前及灌胃第4周、8周、12周時(shí)血糖水平，檢測(cè)前一天禁食不禁水12 h，血糖測(cè)定采用斷尾檢測(cè)法。

6.3 腎臟蘇木素-伊紅(HE)染色:取固定48h后小鼠左側(cè)腎臟，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm；HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色，自來(lái)水返藍(lán)，伊紅染色，1%鹽酸-酒精脫色，梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。

6.4 腎臟免疫組化:4%中性多聚甲醛固定液中腎臟組織石蠟切片，梯度酒精脫蠟至水，0.01%Triton 37℃15min，PBS水洗3次； 抗原修復(fù)，3%H2O2孵育15min，正常山羊血清孵育 37℃15min，傾去，I抗(1∶100稀釋) 4℃ 過(guò)夜；復(fù)溫，PBS水洗，II抗室溫孵育，DAB顯色，常規(guī)脫水，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察，Image-Pro Plus(IPP)軟件分圖片光密度值。

結(jié) 果

1 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠體重的影響 與模型組相比，番石榴葉提取物對(duì)第4周db/db小鼠體重?zé)o明顯影響，可以顯著降低小鼠第8周、第12周體重，見(jiàn)表1。

2 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠血糖的影響 與模型組相比，番石榴葉提取物顯著降低db/db小鼠第4周、第8周、第12周空腹血糖，見(jiàn)表2。

表1 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠體重的影響(g)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

表2 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠空腹血糖的影響(g)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠腎臟HE染色的影響 模型組小鼠腎臟組織可見(jiàn)腎小球擴(kuò)張、球囊壁黏連，同時(shí)伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張、球旁器增生以及系膜細(xì)胞增生、并可見(jiàn)不同程度的腎小管擴(kuò)張、顆粒樣變性等病理改變；番石榴葉提取物組上述病理變化均有改善(圖1)。

圖1 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠腎臟HE染色的影響(×400)

4 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠腎臟免疫組化TGF-β1蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)小鼠腎臟TGF-β1蛋白免疫組織化學(xué)染色圖像分析平均光密度，結(jié)果顯示，與模型組相比，經(jīng)過(guò)12周治療，番石榴葉提取物組TGF-β1蛋白表達(dá)顯著降低，(P<0.05)，見(jiàn)表3(圖2)。

表3 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠腎臟免疫組化TGF-β1蛋白表達(dá)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

圖2 番石榴葉提取物對(duì)db/db小鼠腎臟TGF-β1免疫組化表達(dá)的影響(×400)

討 論

番石榴葉是桃金娘科植物番石榴(Psidium guajava Linn.)的葉及帶葉嫩枝，在我國(guó)主要在福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、四川等地區(qū)栽培，具有燥濕健脾，清熱解毒的功效，是民間用于治療泄痢腹痛、疔瘡腫毒的常用藥，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)番石榴葉可以治療糖尿病。現(xiàn)代藥理研究顯示番石榴葉中的黃酮類、酚酸類，三萜和倍半萜類等化學(xué)成分具有降血糖的活性[6]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)番石榴葉水提物可以顯著降低SHRSP.ZF大鼠血糖，在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，番石榴葉水提物通過(guò)上調(diào)肝臟脂聯(lián)素受體表達(dá)，激活A(yù)MPK-PPAR-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)肝臟游離脂肪酸氧化抑制肝臟糖異生，降低空腹血糖；激活肌肉組織IRS-PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)骨骼肌GLUT4從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，降低餐后血糖[4-5]。

理想的動(dòng)物模型是研究和防治糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)，db/db小鼠是目前使用最廣泛的自發(fā)型肥胖型2型糖尿病模型[7]。db/db小鼠4 號(hào)染色體上的瘦素受體(LepRdb/db)缺失，影響下丘腦攝食中樞，導(dǎo)致食欲過(guò)盛，引起肥胖、高脂血癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗以及糖尿病，該模型同時(shí)也是研究DN腎臟早期形態(tài)學(xué)變化的良好模型，db/db小鼠在第4周即可表現(xiàn)出早期的腎臟病變，腎臟病理改變主要為系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)擴(kuò)張以及基底膜增厚，隨著病程進(jìn)展db/db小鼠腎臟組織學(xué)呈進(jìn)行性變化，8周開(kāi)始出現(xiàn)蛋白尿，14-18周可出現(xiàn)腎小球細(xì)胞肥大、空泡變性、腎小管管腔變窄、腎間質(zhì)小血管玻璃樣變等病理改變，20周以后可出現(xiàn)中到重度蛋白尿，病理表現(xiàn)為腎小球節(jié)段性硬化[8]。

氧化應(yīng)激是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)之一。高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的活性氧簇(ROS)，脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，丙二醛(MDA)蓄積和過(guò)氧化物歧化酶(SOD)減少[9]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇通路活化、DAG-PKC通路激活，導(dǎo)致與腎纖維化相關(guān)的TGF-β表達(dá)增加[10]，病理上可表現(xiàn)為腎小球和腎小管基底膜增厚，腎小球硬化和腎小管-間質(zhì)纖維化等，臨床上表現(xiàn)為尿蛋白增加。TGF-β1是最重要的促纖維化細(xì)胞因子，TGF-β1與腎小管上皮細(xì)胞上的TGF-β受體結(jié)合，可以激活包括Smad2，Smad3和Smad4在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子，刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原、纖連蛋白、層粘蛋白等成分[11-12]，促導(dǎo)致腎臟組織纖維化。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，從治療第4周開(kāi)始，番石榴葉提取物開(kāi)始表現(xiàn)出顯著的降低db/db小鼠體重和空腹血糖的作用，這個(gè)結(jié)果和我們課題組之前的研究結(jié)果是一致的。經(jīng)過(guò)12周的治療，番石榴葉提取物顯著改善db/db小鼠腎臟腎小球擴(kuò)張、球囊壁黏連、腎小球系膜細(xì)胞增生、腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、球旁器增生、腎小管擴(kuò)張顆粒樣變性等腎臟組織病理學(xué)改變。腎臟組織TGF-β1免疫組化蛋白定量測(cè)定結(jié)果提示，番石榴葉提取物具有顯著降低了TGF-β1蛋白表達(dá)的作用。以上結(jié)果可以得出，對(duì)腎臟TGF-β1免疫組化蛋白表達(dá)的降調(diào)節(jié)，是番石榴葉提取物腎臟保護(hù)的作用機(jī)制之一。

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