水蛭經(jīng)炮制后的化學(xué)成分變化研究*

許石鐘

河南省濮陽市中醫(yī)醫(yī)院中藥房(濮陽 457000)

作為臨床中一種傳統(tǒng)的破血逐瘀藥，水蛭粉是由水蛭炮制而成。水蛭粉主要含有蛋白質(zhì)。水蛭的唾液中含有水蛭素、肝素、抗血栓素和組織胺樣物質(zhì)[1-2]。水蛭具有較強(qiáng)的生命力及再生能力，其對炮制工藝有著較高的要求，一旦水蛭未能完全處死，進(jìn)入人體將會影響到患者的身體健康，甚至威脅到患者的生命安全[3]。我國《傷寒論》中最早提出采用“暖水洗”、“熬”等方法對水蛭進(jìn)行炮制，且經(jīng)過多年的實踐發(fā)展，滑石粉湯長期以來一直是水蛭炮制的有效策略[4]。近年來，臨床藥學(xué)對水蛭化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行了深入的探究，并提出了水蛭生用的觀點，該觀點認(rèn)為水蛭生用能夠在一定程度上提升藥物療效，并逐漸被越來越多學(xué)者接受與認(rèn)可[5]。此次研究選取我院新購進(jìn)的水蛭作為研究對象，探究其炮制后氨基酸及甾體類成分變化情況，對研究結(jié)果予以如下總結(jié)與報道。

資料與方法

1 氨基酸的成分分析

1.1 儀器與條件:Beckman Coulter System Gold液相色譜儀由美國貝克曼庫爾特有限公司提供，YD-L650P100-A20體積標(biāo)記器購自深圳市遠(yuǎn)大激光科技有限公司，JC-8000A自動采樣器由青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司提供，Honeywell DT6360STC探測器由深圳市博創(chuàng)時空通訊技術(shù)有限公司提供，TPC170TC-A902嵌入式主板購自深圳市吉方科技有限公司。總流速以0.66ml/min為宜，緩沖液A流速一般為每分鐘0.45ml，緩沖液B流速以0.23ml/min為宜。將檢測波長設(shè)定為570nm，柱后反應(yīng)器溫度在130℃左右，柱溫為53℃～75℃之間。

1.2 水蛭樣品:研究所有生水蛭購自亳州市御康堂貿(mào)易有限責(zé)任公司，經(jīng)過鑒定判斷其為寬體金線蛭，制水蛭則是采用滑石粉對生水蛭燙制而成。

1.3 樣品液的制備及水解:精密稱取適量樣品，在其中加入2 ml 6N鹽酸溶液，放置于5 ml試管中，將試管口封閉，放置于烘箱中，將溫度設(shè)置為120℃，進(jìn)行水解處理，以48 h為宜。48 h后將其取出，放置入105℃環(huán)境下進(jìn)行烘干，將溶劑去除，在其中加入5 ml稀釋緩沖液，并反復(fù)搖晃使其混合均勻，經(jīng)過0.22 u微孔濾膜實施過濾處理，此時可得到樣品溶液，進(jìn)樣為20 μl。

2 甾體類化合物的GC-MS分析

2.1 儀器與條件:Fninigan MAT 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購自廣州市碼斯帕科儀器有限公司，HP-1柱規(guī)格為13.0m×0.25mm ID×0.36um，實施程度升溫，首次升溫為100℃/min，然后保持100℃～190℃/10min，最后升溫為300℃/3min。水蛭樣品同1.1.2。

2.2 樣品溶液制備:精密稱取兩種樣品，每種20g，實施粉碎處理，采用95%乙醇(廣州市江順化工科技有限公司)實施回流處理，一般提取3次左右，每次2 h。對提取液實施合并，經(jīng)過減壓處理后將溶劑予以回收。采用5%KOH乙醇液(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)對剩余殘渣予以溶解，加熱后進(jìn)行為期3 h的回流處理，并對溶劑進(jìn)行回收，對于剩余殘渣可在其中加入適量水，采用乙醚(廣州潔露華生物科技有限公司)實施反復(fù)萃取，將乙醚液進(jìn)行合并，并對乙醚實施回收，采用乙醚對適量殘渣進(jìn)行溶解處理，可得到樣品溶液，稱取適量樣品溶液，將其注入到氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中。

結(jié) 果

1 水蛭經(jīng)過炮制后氨基酸測定結(jié)果分析 經(jīng)過炮制后的水蛭，其氨基酸含量如天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸等成分與炮制前比較明顯降低，氨基酸總量由原來的73.95%降低到45.04%，差異較大，存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2 水蛭經(jīng)過炮制后甾體類化合物GC-MS結(jié)果分析 甾體類化合物組成成分也發(fā)生明顯變化，生水蛭中含有大量膽固醇，而經(jīng)過炮制后，甾體類化合物成分未能檢出，膽固醇氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 水蛭經(jīng)過炮制后氨基酸測定結(jié)果分析 (%)

表2 水蛭經(jīng)過炮制后甾體類化合物GC-MS結(jié)果分析

討 論

生物學(xué)研究報道，作為一種雌雄同體類動物，水蛭通過異體受精，其生命力極強(qiáng)，但無再生能力，因此，對水蛭進(jìn)行炮制時選擇高溫對其進(jìn)行炮制[6-8]。動物類藥材中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)及甾醇等物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)主要組成為氨基酸，其在生物機(jī)體代謝中有著重要的參與作用，因此在動物類藥材評價中往往將氨基酸作為重要質(zhì)量指標(biāo)[9-10]。而所有生物體中都幾乎含有甾體類化合物，其作為生物膜的重要組成部分，是激素產(chǎn)生的的基礎(chǔ)，為生理活動提供了重要的物質(zhì)能源。甾體化合物中含量最高的為膽固醇，其實細(xì)胞膜及血漿脂蛋白的重要組成部分[11]。而當(dāng)膽固醇受到氧化其對生物功能將會產(chǎn)生一定的損害作用。不僅會對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性，造成內(nèi)皮細(xì)胞死亡，而且會對細(xì)胞增殖及內(nèi)皮細(xì)胞柵欄功能起到一定的抑制作用，促使彈性蛋白組成產(chǎn)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致肌動蛋白微絲破裂，對甾體合成產(chǎn)生抑制作用[12-13]。此次研究所選取的水蛭藥材為寬體金線蛭，是我國臨床中常用的動物藥材品種。水蛭中含有水蛭素、蛋白酶抑制劑等多種活性多肽，其成分主要來源于吸血蛭，而寬體金線蛭則屬于不吸血蛭，目前臨床中尚未針對寬體金線蛭進(jìn)行研究報道。對水蛭的炮制多采用的是滑石粉燙制，其溫度通常在200℃以上，在這種高溫條件下，水蛭藥材的化學(xué)成分無疑會產(chǎn)生較大的變化，對膽固醇氧化產(chǎn)物的生產(chǎn)會產(chǎn)生一定的不利影響，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇氧化產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的增加趨勢。臨床研究報道，水蛭經(jīng)過炮制，其位于31KD左右的蛋白質(zhì)含量將會明顯增加，在22KD左右生水蛭及經(jīng)過炮制的水蛭蛋白質(zhì)含量均相對較高[14]。有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)水蛭經(jīng)過炮制后未有高于45KD的蛋白質(zhì)條帶，這很大程度上是由于在200℃高溫燙制下，水蛭中的水溶性蛋白會發(fā)生變性[15]，部分會通過自身釋放蛋白酶轉(zhuǎn)化為游離的氨基酸物質(zhì)或小分子肽，在提取過程中，變性蛋白質(zhì)將會被離心沉淀去除。此次研究中水蛭炮制后氨基酸含量明顯降低，甾體類化合物組成成分也發(fā)生明顯變化，且經(jīng)過高溫炮制，膽固醇氧化產(chǎn)物含量有所增加，提示水蛭炮制會在一定程度上影響到氨基酸及甾體類化合物成分的變化。綜上所述，在高溫炮制作用下，水蛭中的氨基酸含量及甾體類化合物成分均會受到一定的影響，應(yīng)給予高度臨床關(guān)注，確保水蛭藥物的合理應(yīng)用。

[1] 童 凱，李昭玲，閆 燊,等. 川牛膝酒炙和鹽炙前后HPLC化學(xué)指紋圖譜及其主要藥效成分量變化研究[J]. 中草藥，2016，47(4):580-584.

[2] 單 宇，張伽妹，丁月珠,等. 水提取法和仿生提取法研究水蛭不同炮制品的體外抗凝活性[J]. 中國中藥雜志，2016，41(10):1843-1848.

[3] Jorge J C F. Influence of Chemical Composition on the Mechanical Properties of High Strength Steel Weld Metals for Application in Mooring Components[J]. International Journal of Engineering & Technical Research，2016，4(2):71-76.

[4] 王 朝，蔣莉莉，施莉莉,等. 水蛭配合西藥治療糖尿病腎病及對尿微量白蛋白和內(nèi)皮功能的影響[J]. 陜西中醫(yī)，2014，35(10):1306-1308.

[5] 史小蓮，劉俊田，李西寬,等. 水蛭免加熱提取物抗凝血作用及其機(jī)制研究[J]. 山東中醫(yī)雜志，2013，22(11):687-690.

[6] Berti C，Celli A，Marchese P，etal. Environmentally Friendly Copolyesters Containing 1,4‐Cyclohexane Dicarboxylate Units，1‐Relationships Between Chemical Structure and Thermal Properties[J]. Macromolecular Chemistry & Physics，2013，211(14):1559-1571.

[7] 黃學(xué)敏，馬浩亮，馬 驍. 水蛭豬苓降壓丸治療高血壓病及對左心室功能的影響[J]. 陜西中醫(yī)，2013，34(10):1306-1307.

[8] Zheng W J，Wan X C，Bao G H. Brick dark tea: a review of the manufacture，chemical constituents and bioconversion of the major chemical components during fermentation[J]. Phytochemistry Reviews，2015，14(3):499-523.

[9] Smanalieva J，Salieva K，Borkoev B，etal. Investigation of changes in chemical composition and rheological properties of Kyrgyz rice cultivars (Ozgon rice) depending on long-termstack-storage after harvesting[J]. LWT - Food Science and Technology，2015，63(1):626-632.

[10] 孫立麗，任曉亮，張慧杰,等. 基于超高效液相色譜指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)相結(jié)合的何首烏炮制研究[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2017，21(5):164-165.

[11] 劉蓬蓬，徐 珊，張 凡,等. 黃柏炮制前后生物堿和檸檬苦素類成分的變化研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2015，28(1):18-23.

[12] 潘凌云，徐 敏，王 億,等. UPLC-ESI-MS/MS法分析藤黃炮制前后化學(xué)成分的變化[J]. 中成藥，2016，38(5):1098-1103.

[13] Barker P A，Hurrell E R，Leng M J，etal. Carbon cycling within an East African lake revealed by the carbon isotope composition of diatom silica: a 25-ka record from Lake Challa，Mt. Kilimanjaro[J]. Quaternary Science Reviews，2013，66(436):55-63.

[14] 馬麗虹，李可建. 單味水蛭制劑治療缺血性中風(fēng)急性期臨床療效的系統(tǒng)評價[J]. 山東中醫(yī)雜志，2010，21(9):593-594.

[15] 孟祥龍，馬俊楠，張朔生,等. 熟地黃炮制(九蒸九曬)過程中藥效化學(xué)成分量變化及炮制輔料對其影響研究[J]. 中草藥，2016，47(5):752-759.