敏咳湯對實驗性哮喘豚鼠炎性細胞、 炎性介質和細胞因子影響實驗研究*

朱富華 ,王生婷,成 秋,王曉萌,顏靖棠

1.陜西省中醫醫院(西安 710003),2.陜西中醫藥大學兒科研究生(咸陽 712046),3.陜西省寶雞市中心醫院兒科(寶雞 721000)

兒童哮喘是一種常見病、多發病，它嚴重地影響著患病兒童的生活質量和正常學習，近年來其發病率有不斷上升之趨勢，應引起我們的足夠重視[1]。本文探索敏咳湯對支氣管哮喘豚鼠中炎性細胞(ECP)、炎性介質(NO)和細胞因子的影響，報告如下。

材料和方法

1 材 料

1.1 實驗動物:實驗選擇清潔級封閉群幼齡雄性豚鼠50只，購自西安市交通大學實驗動物中心，動物使用許可證號：(2015)第8號，體重(200±20)g，月齡1～2月。室溫在 20～25℃之間，相對濕度50%的環境中飼養兩周后，將豚鼠隨機分為5組，即哮喘模型組、中藥大劑量組、中藥小劑量組、地塞米松片對照組、正常對照組。每組各10只。用不銹鋼的鼠籠分籠飼養，飲用純凈水，自然采光，以常規飼料喂養。

1.2 實驗用藥品:①卵白蛋白(OVA):上海世儀生物科技有限公司生產(產品貨號：77121，規格：10g/瓶);②生理鹽水：杭州美芙醫藥科技有限公司(規格：250ml/瓶)批號：120409；③地塞米松片：廣州嘉禾制藥有限公司(規格：0.75mg/片)，批號：1102093；④敏咳湯：蜜麻黃5g，牡蠣20g， 陳皮、蟬蛻各6g，射干、茯苓、桔梗、葶藶子、蒲公英、桑白皮、連翹、當歸、前胡各10g。(本方每劑藥131g相當于131g中藥飲片)由廣東三九制藥廠有限公司提供。加熱濃縮成1.27g/ml之濃度。

1.3 實驗用試劑：IL-3試劑盒、IL-2試劑盒、IL-4試劑盒和IL-13試劑盒以及嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)試劑盒，美國Microelisa Stripplate 公司生產，批號：20150502B。豚鼠一氧化氮(NO)試劑盒48T(產品批號YM-S2499)由上海遠慕生物科技有限公司生產。

1.4 實驗儀器：電子稱；醫用超聲霧化吸入器(壓縮式霧化器，上海鹿得醫療器械貿易有限公司生產)；高速冷凍離心機(德國Ken-dro公司產品)；恒溫箱；自動酶標儀(美國Bio-Rad公司產品)；其他如止血鉗，手術刀，注射器，灌胃針，燒杯，微量移液器，冰箱等(陜西省中醫藥大學第二附屬醫院實驗室提供)。

2 方 法

2.1 造模方法：致敏階段分別對哮喘模型組、中藥大小劑量組及地塞米松組豚鼠采用腹腔注射10%卵白蛋白1ml，進行致敏。[2]正常組豚鼠以生理鹽水1ml腹腔注射作為對照觀察。

激發階段：自注射第14天起，對哮喘模型組、中藥大劑量組、中藥小劑量組及地塞米松對照組每天上午將豚鼠置于4L霧缸內，用1%卵白蛋白溶液超聲霧化20至30s,關閉機器后取出豚鼠觀察癥狀，激發至哮喘發作(即出現煩躁不安、呼吸急促、嗆咳，身體顫抖、點頭及伏地現象)，連續1周，以建立哮喘模型。空白組以生理鹽水代替霧化。

2.2 給藥方法和途徑:造模成功后(實驗第28天)，清晨進行最后一次霧化，霧化90min后開始給藥，正常對照組和哮喘模型組每日2次均用2.5ml生理鹽水灌胃。其余兩組敏咳湯組(按大劑量組：小劑量組=4∶1，敏咳湯大劑量組組加熱濃縮成2.54 g/ml、小劑量組為0.635 g/ml的濃度計算)、地塞米松片對照組(地塞米松片對照組3.5mg/kg·d即給地塞米松片混懸液 0.7 mg/d)每次2.5 ml，每日2次，連續給藥7 d。

2.3 標本采集:實驗觀察結束后，稱豚鼠體重，用乙醚麻醉成功后，將豚鼠固定，常規消毒皮膚，沿頸正中線用剪刀剪開皮膚，鈍性分離，暴露心臟，進行心尖部抽取全血3 ml，然后放入離心機中，以3000 r/min，離心10 min，用吸管抽吸上層血清。

豚鼠支氣管肺泡灌洗液：將豚鼠于實驗觀察結束后稱重，經腹腔注射烏拉坦麻醉成功后固定，予以皮膚常規消毒，沿頸正中線剪開皮膚,打開胸腔后分離左、右支氣管，并結扎右支氣管，取5號頭皮針剪去針頭,將其插入氣管內0.5～1.0cm，同時結扎固定，連接注射器，用0.9%氯化鈉注射液反復灌洗3次(10 ml/次),回吸率保持在80%左右,用離心管收集肺泡灌洗液(BALF),然后置于離心機中，以1000 r/min 離心10min后收集上清液。

2.4 指標檢測:支氣管哮喘豚鼠模型血清中，白介素3(IL-3)、白介素2(IL-2)、白介素13(IL-13)和一氧化氮(NO)以及嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)的含量和支氣管肺泡灌洗液中的白介素4(IL-4)含量均采用ELISA酶標免疫分析法測定。

結 果

1 一般狀況 在實驗激發前后正常對照組豚鼠的皮毛柔順、光滑，呼吸平穩活躍，進食進水量無明顯變化。哮喘激發后除正常對照組外，其余四組豚鼠皮毛沒有激發前光滑、柔順，進食進水量較前減少。哮喘激發時,各組均出現呼吸急促，噴嚏或嗆咳，張口呼吸，節律不齊，身體抖動，點頭、伏地，腹式呼吸較明顯，甚出現口鼻及尾尖輕度紫紺，躁動不安，少部分出現休克、跌倒等現象；激發后活動明顯減少或俯臥不動，狀態發生改變。

2 敏咳湯對哮喘癥狀持續時間的影響 見表1。敏咳湯大、小劑量組與哮喘模型組相比(P<0.05)，說明敏咳湯能縮短哮喘的發作時間；敏咳湯大劑量組與地塞米松對照組無明顯差異(P>0.05)，說明敏咳湯大劑量組與地塞米松組相比療效相當；敏咳湯大劑量組與敏咳湯小劑量組相比有差異(P<0.05)，說明大劑量組療效優于小劑量組。

3 敏咳湯對哮喘豚鼠血清中IL-2、IL-3、IL-13含量的影響 見表2。通過本次實驗發現，哮喘模型組豚鼠血清中IL-2的含量水平比正常對照組明顯降低,差異有統計學意義(P<0.01)。敏咳湯小劑量組比哮喘模型組豚鼠血清中IL-2水平升高，但無統計學意義(P>0.05)。敏咳湯大劑量組和地塞米松組均比哮喘模型組豚鼠血清中IL-2水平升高,而且差異有統計學意義(P<0.05)。敏咳湯大劑量組和敏咳湯小劑量組相比差異有統計學意義(P<0.05)。敏咳湯大劑量組和地塞米松組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。

敏咳湯對哮喘豚鼠血清中IL-3含量的影響，模型組、用藥組與正常對照組相比較有差異有統計學意義(P<0.05)。用藥組與哮喘模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；模型組與地塞米松、敏咳湯大劑量組相比較差異有統計學意義(P<0.05)。

敏咳湯對哮喘豚鼠血清中IL-13含量的影響，通過本次實驗發現，哮喘模型組豚鼠血清中IL-13的含量水平比正常對照組明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01)。敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組比哮喘模型組豚鼠血清中IL-13水平降低,其差異有統計學意義(P<0.05)。敏咳湯大劑量組和敏咳湯小劑量組相比差異有統計學意義(P<0.05)；敏咳湯大劑量組和地塞米松組相比,差異沒有統計學意義(P>0.05)。

表2 哮喘豚鼠血清中IL-2、IL-3、IL-13的變化(pg/L)

4 敏咳湯對哮喘支氣管中肺泡灌洗液(BALF)IL-4含量的影響 見表3。哮喘模型組IL-4含量明顯提高，哮喘模型組與正常對照組比較,差異有顯著性統計學意義(P<0.01)。地塞米松對照組、敏咳湯小劑量組、敏咳湯大劑量組與哮喘模型組比較, 差異有統計學意義(P<0.05)。地塞米松對照組與敏咳湯大劑量組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。敏咳湯大、小劑量組相比，差異無統計學意義(P<0.05)。

表3 哮喘豚鼠BALF中IL-4的變化(ng/L)

5 敏咳湯對哮喘豚鼠血清中ECP、NO含量的影響 見表4。實驗中哮喘豚鼠血清中ECP的變化，哮喘模型組、地塞米松對照組、敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組與正常對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.05)。地塞米松對照組、敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組與哮喘模型組比較(P<0.05)。敏咳湯小劑量組與地塞米松相比較，差異有統計學意義(P<0.01)。敏咳湯大劑量組與敏咳湯小劑量組相比較(P<0.05)，差異有統計學意義。

實驗中哮喘豚鼠血清中NO的變化，模型組與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。地塞米松對照組、敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組與哮喘模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。地塞米松對照組與敏咳湯大劑量組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。敏咳湯大、小劑量組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 哮喘豚鼠血清中ECP、NO的變化

討 論

支氣管哮喘(Bronchial asthma，簡稱支哮)是由多種炎癥細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞)、細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾患。這種慢性炎癥導致氣道高反應性的增加，通常出現廣泛多變的可逆性氣流受阻，并引起反復發作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間發作、加劇，多數患者可自行緩解或經治療緩解[3]。關于哮喘發病機制，目前有：變態反應、氣道炎癥、氣道高反應性、神經機制之說[4]。

敏咳湯是我院名老中醫龔老師的經驗方。龔老根據張仲景《金匱要略》曰：“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”。[5]此方是原為治療寒證哮喘。龔老在射干麻黃湯方的啟發下，別出心裁，根據兒童哮喘的病理特點化裁而來的，方中炙麻黃辛溫宣肺平喘，外散風寒；連翹辛涼清熱解毒，透邪外出，以炙麻黃辛溫與連翹辛涼合用，體現寒溫并治，針對邪易化熱，共為君藥。陳皮、茯苓、前胡、桔梗化痰止咳，以杜絕生痰之源；葶藶子，桑白皮，泄肺平喘，兩者合用擅泄肺中痰水，以除“伏痰”之根，共達化痰止咳平喘之功，共為臣藥。射干利咽祛痰散結；蒲公英既可清解火熱毒邪，防止外邪入里化熱化火，又可泄降滯氣，以降肺之痰氣壅滯；蟬衣息風抗敏，解痙平喘，緩解氣管攣急，縮短病程，提高療效；牡蠣重鎮平喘，既能重鎮潛陽，又可治煩躁失眠，并能拮抗長期使用中藥麻黃、西藥氨茶堿和β受體激動劑所引起的心臟毒性(心動過速、心律失常)等副作用；當歸既能活血化瘀，改善肺部的血液循環；又可潤腸通便,肺與大腸相表里,腑氣通則肺氣利，共為佐藥。甘草調和主藥，為使藥。全方配伍得當，寒溫并用，宣降協調，使風邪得解，伏痰以除，血活瘀化，肺氣通暢，咳止痙解，哮癥自平[6]。組方思想也反應了中醫對哮喘治療的不斷延伸，從痰從瘀[7]，從風論治[8]。

實驗結果：哮喘激發后除正常對照組外，其余四組豚鼠皮毛沒有激發前光滑、柔順，進食進水量較前減少。哮喘激發時,各組均出現呼吸急促，噴嚏或嗆咳，張口呼吸，節律不齊，身體抖動，點頭、伏地，腹式呼吸較明顯，甚出現口鼻及尾尖輕度紫紺，躁動不安，少部分出現休克、跌倒等現象；激發后活動明顯減少或俯臥不動，狀態發生改變。模型建立成功。豚鼠血清中NO、ECP、IL-3、IL-13的含量和支氣管肺泡灌洗液中IL-4的含量降低；血清IL-2的含量升高。

實驗結果敏咳湯湯有降低血清中NO、ECP、IL-3、IL-13的含量、降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4的含量；提高血清IL-2、的含量。IL-3增進嗜酸性細胞分化、成熟、內皮細胞黏附、激活和脫顆粒，增進肥大細胞分化、成熟。IL-4和IL-13促進B淋巴細胞轉化，促進IgE生成，促進肥大細胞成熟、分化，調節細胞黏附分子生成。一氧化氮(NO)高濃度時具有上皮細胞毒性作用，可以加重氣道的炎性反應。嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)大量研究證實嗜酸粒細胞及其釋放的細胞介質。

通過實驗，可知敏咳湯從哮喘發病多個環節阻滯哮喘的發生。①從表1可知敏咳湯可縮短哮喘發生癥狀的持續時間。②哮喘患兒常常表現為Th1/Th2細胞因子免疫應答失衡，Th1分泌受到抑制，導致IFN-γ、IL-2等水平下降[9]。敏咳湯可升高IL-2的含量，恢復Th1/Th2類細胞因子免疫應答失衡，從而減少哮喘的發生。③敏咳湯可降低IL4和IL-13的含量，減少LgE合成的細胞因子，阻滯哮喘的發生。④IL-3在支氣管哮喘發病中，一則阻滯嗜堿、肥大細胞增值和活性，二則減少嗜酸細胞活性[4]。敏咳湯可減少IL-3的含量，較少哮喘的發作。⑤敏咳湯可降低NO的含量。減少氣道的炎癥。這種機制在于NO能阻斷嗜酸性粒細胞凋亡，從而間接加重或促進嗜酸性粒細胞炎癥反應。同時作為信使的NO可抑制TH1細胞，促進TH2細胞的激活,致使激活炎性細胞的細胞因子IL-4生成過多，加重氣道炎癥反應，有研究表明,哮喘病人呼出氣中NO含量較正常人高2～3倍，提示哮喘的呼吸道炎癥與NO的大量生成有關。臨床通過測定其含量，作為診斷和檢測哮喘的一種指標[10]。⑥降低ECP可以減少哮喘季節性的發作，如花粉的誘發,減少氣道的炎癥反應。

[1] 朱富華,張瑞君,閆 玲. 中醫變態反應病學[M].西安: 陜西科技出版社,2006:1-3.

[2] 汪受傳,俞景茂.中醫兒科臨床研究[M].北京:人民衛生出版社,2009，164-165.

[3] 申昆玲. 兒科疾病臨床診療思維 [M].北京:人民衛生出版社,2016:358.

[4] 李明華, 殷凱生,朱栓立. 哮喘病學[M].北京:人民衛生出版社,1998:83-94.

[5] 李振吉,王永炎.中醫經典必讀[M].北京:中國中醫藥出版社, 2005:124.

[6] 朱富華,姚桂芳, 馮玉章.加減射干麻黃湯治療兒童哮喘32例及峰速值療效觀察[J]. 陜西中醫,2001，23(6):487-488.

[7] 朱富華.論“亢則害，承乃制” ——變態反應病中醫自亢學說[J].中醫雜志，2009,49(1)：16-17.

[8] 吳興和. 四蟲祛風固本湯治療支氣管哮喘急性發作64例臨床觀察[J].中醫雜志，2001,42(8)：476.

[9] 蔣玉紅,王亞秋,孫寬周.支氣管哮喘患者TH細胞的極化狀態及臨床意義[J].中國當代兒科雜志,2006,8(5):3379-3381.

[10] 楊 龍,張建青 .呼出氣一氧化氮與哮喘相關性研究進展[J]. 海南醫學,28(7)：1137-1140.