青花菜P450CYP79F1全長克隆、表達及其與不同器官中萊菔硫烷含量的相關性分析

李占省，劉玉梅，方智遠，楊麗梅，莊木，張揚勇，呂紅豪

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青花菜P450全長克隆、表達及其與不同器官中萊菔硫烷含量的相關性分析

李占省，劉玉梅，方智遠，楊麗梅，莊木，張揚勇，呂紅豪

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所/農業部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100081）

【目的】克隆青花菜細胞色素家族P450，分析其序列特征，闡明其在不同發育時期器官中的表達情況及其與萊菔硫烷含量的關系，為進一步揭示萊菔硫烷合成機理提供科學依據，為青花菜品種改良和新品種選育奠定基礎。【方法】通過5′和3′端RACE克隆技術獲得青花菜全長序列，利用DNAMAN 6.0進行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二級結構預測，結合在線分析程序和軟件進行基因和編碼蛋白生物信息學分析；利用熒光定量PCR技術研究在不同發育器官中的表達情況；結合HPLC方法測定各相應時期器官中萊菔硫烷含量，包括青花菜發育時期的根、莖、葉，成熟花球，抽薹期花蕾（頂端蕾、成熟蕾、開花前1 d的蕾和花）和種子；對表達量與和萊菔硫烷含量進行相關性分析。【結果】獲得了全長序列，GenBank登錄號為MG012890，該基因全長2 014 bp，包含一個1 620 bp的開放讀碼框（ORF），編碼540個氨基酸；編碼的蛋白與甘藍、白菜、芥藍和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上；生物信息學分析表明該基因編碼的酶蛋白有2個信號肽和2個跨膜結構域，為親水性穩定蛋白，Wolf Psort預測其亞細胞定位于細胞質中；在根和莖中的表達量較高，葉中表達量最低，在花器官發育時期，自頂端蕾到花發育過程中呈現逐漸降低的表達趨勢，種子中該基因表達量與花處于同一水平。相關性分析顯示，青花菜發育時期的根、莖、葉、成熟花球、抽薹期花蕾和種子中萊菔硫烷含量與表達量無顯著相關關系，但抽薹期花蕾自頂端花蕾到花中萊菔硫烷生成量與表達量呈顯著正相關關系（=0.96，<0.05），在調控萊菔硫烷的生成方面起重要作用，尤其是在生殖器官花蕾的發育過程中，能夠顯著上調萊菔硫烷的生成量。【結論】在青花菜不同發育器官中對萊菔硫烷的生成發揮著重要調控作用，可能與青花菜不同器官中萊菔硫烷含量多樣性密切相關。

青花菜；萊菔硫烷；；表達分析；HPLC

0 引言

【研究意義】青花菜（var.）又名西蘭花、綠菜花等，十字花科蕓薹屬甘藍類蔬菜變種，一、二年生植物。青花菜營養全面，富含多種礦物質和維生素，同時富含4-甲酰基亞磺酰基丁基硫甙（glucoraphanin，GRA），4-甲酰基亞磺酰基丁基硫甙能被位于液泡中的黑芥子酶水解生成異硫氰酸鹽類物質——萊菔硫烷（sulforaphane，SF或SFN）。流行病和臨床醫學研究表明，萊菔硫烷能夠顯著降低肝癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌和結腸直腸癌等多種癌癥的患病率[1-7]，在降低糖尿病、高血壓和心腦血管疾病等發病率方面具有很好的醫學前景[8-11]。據報道，青花菜不同器官中萊菔硫烷含量差異較大，不同基因型材料也存在顯著差異，種子中萊菔硫烷含量最高，芽苗在前期（5—7 d）含量較高，后期降低，花球中萊菔硫烷含量高于幼莖，葉片最低。另有研究表明，青花菜葉片中萊菔硫烷含量處于較高水平，這可能由不同發育時期的樣品和基因型造成[12-18]。擬南芥研究結果表明，為萊菔硫烷代謝的上游調控基因，在萊菔硫烷的合成方面可能具有重要作用[19-22]。因此克隆青花菜該基因全長，分析其在青花菜不同發育時期各器官中的表達量與萊菔硫烷含量的相關性，將為進一步闡明青花菜萊菔硫烷含量分布的器官多樣性提供科學依據，對青花菜不同器官的科學利用和新品種選育都具有重要意義。【前人研究進展】擬南芥硫甙代謝研究表明，能夠將長鏈或短鏈甲硫氨酸催化形成相應的醛肟，尤其是短鏈脂肪酸（1C-4C）的合成尤為重要[19,21]。萊菔硫烷的前體為4-甲基亞磺酰基丁基硫甙，為短鏈脂肪酸合成途徑，因此，在調控4-甲基亞磺酰基丁基硫甙的生成方面尤為重要。另外，過表達能夠調控擬南芥株高（變矮）和植株大小，且與根部發育也具有直接的調控作用[23-25]。王紅波等[26]通過轉基因技術研究指出，的過表達能夠顯著增加4-甲基亞磺酰基丁基硫甙含量，吲哚組硫甙成分則相對降低，暗示該基因與脂肪族硫甙和萊菔硫烷代謝密切相關。過表達能夠增加脂肪族硫甙成分在擬南芥上同樣得到了證實[25,27-28]。【本研究切入點】青花菜富含抗癌活性成分萊菔硫烷已逐漸被大眾認知，青花菜不同器官中萊菔硫烷含量多樣性分布的原因目前尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】從青花菜中克隆獲得全長，分析其家族序列特征，研究其在青花菜不同發育時期各器官中的表達特性與萊菔硫烷含量相關性，為深入研究青花菜不同器官中萊菔硫烷代謝和轉運機理奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2015年8月至2017年7月在中國農業科學院蔬菜花卉研究所進行。

1.1 試驗材料

青花菜材料B691為純合自交系材料（自交16代），由中國農業科學院蔬菜花卉研究所甘藍青花菜課題組選育。

試驗材料于2015年8月中旬定植于露地，每份材料設置3次重復，每重復種植11株，行間距為45 cm×55 cm。2015年10月初開始對試驗材料的根、莖、葉、發育時期的花球進行取樣，待植株移栽到溫室后，對抽薹期的花蕾（頂端蕾、成熟蕾、開花前1 d蕾和花）進行取樣。相同材料保存2份，一份于超低溫保存后真空冷凍干燥，機械粉碎后密封保存；另一份提取總RNA進行定量表達分析。

1.2 青花菜CYP79F1克隆

青花菜總RNA的提取采用Trizol法，RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒（MMLV反轉錄試劑盒）均由日本TaKaRa公司購置。按照TaKaRa試劑盒要求除去痕量DNA的總RNA，進行cDNA第一條鏈的合成。5′-RACE cDNA第一鏈的合成：根據Invitrogen公司Gene- RacerTM試劑盒要求進行總RNA的脫磷、脫帽處理，然后在5′端加上RNA Oligo，利用SuperScript反轉錄酶Ⅲ，以基因特異性引物進行反轉錄（表1）。3′-RACE cDNA第一鏈合成仍參照Gene-RacerTM試劑盒要求進行，所需引物信息見表1。

cDNA核心克隆則參照報道的已知序列（Genebank：KP693683）設計核心引物（表1）。反應體系為：Taq 2X Master Mix（百泰克）25 μL，正向引物（10 μmol?L-1）1 μL，反向引物（10 μmol?L-1）1 μL，cDNA模板（80—100 ng）1 μL，雙蒸水22 μL，共50 μL。PCR擴增條件為：95℃變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸10 min。從反應產物中取10 μL在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。

將所有擴增產物進行1.5%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產物并與Blunt Zero Cloning載體連接，構建重組質粒轉化DH5感受態細胞，篩選陽性克隆，送至華大生物技術有限公司測序，將測序結果與保守區序列進行比對拼接。

1.3 生物信息學分析

利用DNAMAN 6.0進行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二級結構預測，在線NCBI進行序列處理（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/，Vecscreen）與分析，Blastx和Blastp分析，蛋白質一級結構分析（http://web.expasy.org/protparam/，ProtParam）和修飾分析（http://myhits.isb-sib.ch/ cgibin/motif_scan，MotifScan），跨膜預測分析（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，TMHMM），系統進化樹構建在線分析（NCBI），亞細胞定位在線分析（https:// omictools.com/wolf-psort-tool，WoLF PSORT）。

1.4 青花菜CYP79F1表達分析

利用軟件Primer Premier 5.0軟件設計擴增引物，引物序列為雙向引物為F（5′-3′）：GTCACGCCAGACG AAATCAAA和R（5′-3′）：GCACAAGCCTGTCTTTT CCAACT，目標長度為169 bp，內參基因為-12，引物序列F（5′-3′）：GGCTCTATCTTGGCTTCTCTCA GT和（5′-3′）：CCAGATTCATCATACTCGGCTTT。參照TaKaRa SYBR? Green PCR Master Mix說明進行操作，在ABI 7500實時定量PCR儀上進行PCR擴增。反應體系為50 μL：25 μL SYBR? Premix，5 μL cDNA模板，雙向引物各1 μL，1 μL Rox，加蒸餾水至50 μL。PCR反應程序為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，40個循環，每樣品各設置3次重復。反應完成后進行融解曲線和熒光值變化曲線分析，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達情況。

表1 CYP79F1擴增引物信息

采用實時定量PCR時各樣品加樣量均為2 μL，然而由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉錄效率誤差等影響，每個樣品2 μL的cDNA含量并不完全相同，為校正此差異，使用內參基因（不同樣品間表達量基本恒定）進行校正。根據Real-time PCR原始檢測結果，按照2-△△ct相對定量法計算出各樣品的目的基因相對定量結果[16]。

1.5 萊菔硫烷含量的提取與HPLC分析

青花菜不同器官中萊菔硫烷含量的提取與HPLC分析參照李占省等[17,29]的方法進行。

1.6 相關性分析與數據處理

利用統計學方法，將青花菜不同發育時期各器官中基因的表達量與萊菔硫烷含量進行相關性分析，具體采用相關性分析。試驗數據采用Excel 2003進行基本處理，方差分析和卡方檢驗采用SPSS 17.0軟件，試驗結果用平均值±標準誤（mean±SD，n=3）表示，one-way ANOVA用于顯著性檢驗，多重比較采用Duncan’s新復極差法分析（<0.05）。

2 結果

2.1 青花菜CYP79F1全長克隆

根據PCR產物5′-RACE和3′-RACE擴增產物測序并拼接，長度為2 014 bp的序列（圖1），前邊包含62個非編碼區，從63處開始翻譯，到1 685 bp處終止，將拼接后的序列在線Blastx分析（NCBI），結果如圖2所示，其中的小寫字母通常被設定為沒有三維結構的氨基酸。核心cDNA序列包含一個完整的1 620 bp的開放閱讀框（open reading flame，ORF），5′端有62 bp的非翻譯區（untranslate region，UTR），富含A和T，A（597）和T（541）的總含量達56.5%，G（459）和C（417）含量占總含量的43.5%。經DNAMAN 6.0分析和NCBI在線Blastx分析（圖2），該基因編碼區編碼一條540個氨基酸殘基的多肽，分子量61.434 kD，等電點8.29，pH 7.0時的帶電荷數（ch）為6.63，3′端具有完整的Poly A尾巴。該基因檢測到2個甲基化位點，DAM甲基化酶對應位點為GATC 2-A，DCM甲基化酶對應位點為CCWGG 2-C。該基因序列已在GenBank注冊，登記號為MG012890。

2.2 CYP79F1編碼蛋白質的特性分析

該基因編碼區發現22個抗原肽段，其分值和長度變化分別為1.03—1.19和6—31個氨基酸。

1—4代表3端′端RANCE克隆，6—7為核心區克隆，8—9為5′端RANCE克隆，M為5000 bp

圖2 CYP79F1與甘藍型油菜blastx比對分析結果

經氨基酸特性分析，構成蛋白質中共存在20種氨基酸，賴氨酸（Leu）含量最高（10.3%），其次是精氨酸（Arg）和谷氨酸（Glu），分別占6.9%，然后依次是甘氨酸（Gly）（6.5%）、異亮氨酸（Ile）和丙氨酸（Ala）（6.3%），色氨酸（Trp）含量最低，為1.5%。就構成氨基酸的特性而言，該蛋白包含82個強堿性氨基酸（H、K和R），66個強酸性氨基酸（D和E），240個疏水氨基酸（A、F、I、L、M、P、V和W）和152個極性氨基酸（C、G、N、Q、S、T和Y），預測該蛋白為親水性蛋白（親水平均值-0.11，疏水平均值-0.26）。

Blastp搜索顯示，CYP79F1屬于細胞色素家族P450超級家族，編碼540個氨基酸。Motif Scan 分析顯示，該蛋白存在細胞色素P450C半胱氨酸血紅素-iron配體信號（Cytochrome P450 cysteine heme-iron ligand signature），位于第469—478氨基酸處。PROSITE數據庫分析表明，該蛋白存在2處酰胺化位點（AMIDATION Amidation site），207—210和471—474；6處酪蛋白激酶II磷酸化位點（CK2_ PHOSPHO_SITE Casein kinase II phosphorylation site），246—249、307—310、318—321、344—347、458—461和509—512；4處N-豆蔻酰化位點（MYRISTYL N-myristoylation site），129—134、293—298、428—433和478—483。此外發現，6處蛋白激酶C磷酸化位點（PKC_PHOSPHO_SITE Protein kinase C），156—158、202—204、307—309、390—392、432—434和471—473；1處酪氨酸激酶磷酸化位點（TYR_PHOSPHO_SITE Tyrosine kinase phosphorylation site），434—442。

TMHMM顯示，該蛋白為跨膜蛋白，存在2處跨膜區，第一個位于編碼氨基酸7—35處，包含29個氨基酸；第二個位于編碼氨基酸472—500處，包含29個氨基酸，其結構詳見圖3。該蛋白二級結構組成為：45%的H（alpha-helix）、6%的E（beta-sheet）和47%的C（loop或coil）。利用SWISSMODEL對青花菜CYP79F1蛋白的三級結構進行預測，詳見圖4。亞細胞定位預測位于細胞質中。

2.3 CYP79F1 蛋白的同源比對分析

同源分析表明，該CYP79F1蛋白與十字花科作物中的甘藍型油菜（）、野生甘藍（）、芥藍（var）、白菜（）和蘿卜（）等氨基酸序列高度同源，相似性分別為99%、99%、99%、97%和95%，其次是十字花科的菘藍（），又名北板藍根，相似性為94%，這為分析兩種基于該基因代謝中的相似成分與調控機理提供了依據[30]。

2.4 CYP79F1的表達分析

定量表達分析顯示，在青花菜的根和莖中表達量最高，其次是頂端蕾、開花前1 d蕾、成蕾、花、葉和花球，種子中該基因的表達量與抽薹期花中的表達量處于同一水平（圖5）。從花蕾發育期可以看出，該材料自頂端蕾到花的發育過程中基本呈現逐漸降低的表達趨勢，該結果已經多次驗證并報道[16,31]，暗示與花器官發育和激素代謝密切相關，其調控機理需要深入研究。

2.5 青花菜中萊菔硫烷含量HPLC分析

HPLC分析表明，青花菜不同發育時期各器官中萊菔硫烷含量差異顯著（<0.05）（圖6）。結果表明，種子中萊菔硫烷含量最高，平均含量為4 855.64 mg?kg-1DW，與當前報道一致[14-18]。花器官發育時期總體含量處于較高水平，平均值為1 027.35 mg?kg-1DW，含量最高的為頂端花蕾（1 327 mg?kg-1DW），然后依次是成蕾（1 001.81 mg?kg-1DW）、開花前1 d蕾（994.39 mg?kg-1DW）和花（786.20 mg?kg-1DW），其余器官中，花球（456.45 mg?kg-1DW）高于幼莖（282.86 mg?kg-1DW），葉片（160.46 mg?kg-1DW）中萊菔硫烷含量處于較低水平，根中萊菔硫烷含量最低（17.73 mg?kg-1DW）。同時，萊菔硫烷含量檢出值在花器官發育時期呈現出一定的變化規律，表現為頂端花蕾發育到花的過程中呈逐漸降低的趨勢，頂端蕾中含量最高，是根中萊菔硫烷檢出值的75倍，暗示萊菔硫烷含量合成與植物分化可能存在一定的關系。

圖3 CYP79F1蛋白跨膜結構預測

A和B分別代表不同角度的3D圖 Different points of 3D view shown by A and B

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercases indicated significant differences at P＜0.05 level. The same as below

圖6 青花菜不同器官中萊菔硫烷含量HPLC分析

2.6 青花菜不同發育器官中萊菔硫烷含量與CYP79F1表達量相關性分析

相關性分析表明，表達量與根、莖、葉、花球、頂端蕾、成蕾、開花前1 d蕾、花和種子中萊菔硫烷生成量間的相關系數為-0.273，負相關性不顯著（=0.478）（表2）。為了明確頂端花蕾發育到花的過程中萊菔硫烷含量逐漸降低是否與表達量具有顯著相關性，將該發育時期的萊菔硫烷含量與對應器官的基因表達量進行相關性分析。結果發現，兩者呈顯著正相關關系，相關系數為0.959（=0.041）（表3）。表明在青花菜花器官發育中與萊菔硫烷的積累具有明顯相關性，可能發揮了直接調控作用。

表2 不同器官中萊菔硫烷含量與基因表達量相關性分析

表3 抽薹期花蕾萊菔硫烷含量與基因表達量相關性分析

*表示顯著相關（＜0.05）

* indicate significant correlation (＜0.05)

3 討論

在調控脂肪族硫甙合成方面發揮著重要作用，與青花菜中萊菔硫烷生成量密切相關，同時在植物發育過程中起著重要的調控作用[14,20-21,23]。目前，擬南芥中已經克隆該基因（AT1G16410），該基因屬于細胞色素家族P450成員，在基因組中的長度為3 383 bp，其cDNA為1 200 bp。油菜中該基因位于基因組scaffold_526區域內，該scaffold DNA全長為436 263 bp。青花菜基因組不同于擬南芥和油菜，存在多倍化和重組事件，同時不同變種之間往往存在基因變異的可能，而青花菜中有關該基因與萊菔硫烷方面的研究鮮有報道。因此，本研究通過RACE技術，從青花菜中獲得mRNA全長為2 014 bp，同源比對結果表明，該序列與擬南芥、油菜基因相似性分別為86%和99%，與油菜親緣關系更近，表明該基因在蕓薹屬異源四倍體基因組中能夠穩定遺傳，暗示了其在進化和重組中的保守性。經在線分析（NCBI），與該基因同源的還有芥藍和野生甘藍，其相似性均為99%，再次驗證了該克隆的準確性和保守性[32]。

目前，功能已在擬南芥和部分蕓薹屬作物中獲得驗證[19,21]。本研究預測青花菜中亞細胞定位于細胞質中，與當前報道一致，同時，編碼蛋白為親水性跨膜蛋白，存在2處跨膜區，各含有3個P450信號序列，含有2個信號肽序列，這與擬南芥上有關該基因在內質網上發揮功能的定位與結論一致[21,33]。此外，本研究揭示了該編碼蛋白存在2處酰胺化位點，6處酪蛋白激酶II磷酸化位點，4處N-豆蔻酰化位點，6處蛋白激酶C磷酸化位點和1處酪氨酸激酶磷酸化位點，這方面研究尚未見報道，該發現為深入研究CYP79F1高級結構和功能修飾位點提供了依據和支持[34]。

本研究發現，在青花菜不同發育器官中存在明顯的表達特異性，萊菔硫烷的生成量在不同器官存在多樣性。在根中和莖中表達量較高，但相應器官中萊菔硫烷含量并不是處于較高水平，種子中萊菔硫烷含量處于最高水平，但其表達量并不高。相關性分析結果表明，青花菜發育不同發育時期的器官中，表達量與萊菔硫烷的生成量沒有顯著相關性，但在抽薹期發育的花蕾中則呈現出顯著的正相關關系，暗示該基因在花器官發育過程中可能直接參與了萊菔硫烷的代謝調控，該發現也為少數報道該基因間接參與植物激素代謝和細胞分化途徑提供了參考[35-37]。

由此可見，青花菜發育時期不同器官中萊菔硫烷含量多樣性是一個復雜的調控網絡和運輸機制。本研究發現，在生殖器官中總體表達較為活躍，而在營養器官種呈現出不同的表達水平，營養器官中萊菔硫烷HPLC檢測值明顯低于生殖器官（花器官和種子），暗示在調控萊菔硫烷的生成量方面發揮了重要調控作用，但營養器官和生殖器官間是否存在萊菔硫烷的主動運輸關系，還需要進一步驗證。

此外，為脂肪族硫甙上游調控基因，尤其是能夠直接調控3C和4C脂肪族硫甙生成，而對應的下游硫甙包括GRA、PRO、NAP等，這些硫甙成分與青花菜等十字花科蔬菜（作物）的風味、植保和營養密切相關，因此該基因可能在十字花科蕓薹屬作物中發揮了重要的調控作用[38-41]。本研究結論為深入研究與蕓薹屬作物硫甙成分與風味奠定了基礎。與細胞分化和細胞增殖密切相關，這與擬南芥中報道的該基因能夠調控擬南芥株高和大小的結論相一致[36-37]，也暗示了可能參與了多個代謝途徑的調控。

4 結論

利用RACE技術從青花菜中獲得了全長（2 014 bp），ORF為1 620 bp，編碼540個氨基酸。該基因屬于P450基因超家族，各含有3個P450信號序列，含有2個信號肽序列，屬于親水性跨膜蛋白，亞細胞定位于細胞質中，其編碼的蛋白與油菜、芥藍和野生甘藍等蕓薹屬蔬菜具有高度同源性。在青花菜不同發育器官中存在明顯的表達特異性，在營養器官根和莖中表達量最高，其次是花器官發育時期，總體處于較高水平，與花器官發育呈負相關關系。結合各時期發育器官中萊菔硫烷含量變化，推測該基因通過組織表達特異性，可能直接參與調控青花菜不同發育器官中萊菔硫烷的生成和積累。

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（責任編輯 趙伶俐）

Full Length Cloning, Expression and Correlation Analysis of P450Gene with Sulforaphane Content in Different Broccoli Organs

LI ZhanSheng, LIU YuMei, FANG ZhiYuan, YANG LiMei, ZHUANG Mu, ZHANG YangYong, Lü HongHao

(Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biological and Genetic Improvement of Horticultural Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081)

【Objective】The aim of this study was to clone the full length of P450 familygene from broccoli, investigate its sequence characteristic and analyze its expression and correlation with sulforaphane content in different developmental broccoli organs. These findings will provide a scientific basis for further revealing the mechanism of sulforaphane metabolism in broccoli and lay a practical foundation for the genetic improvement and breeding of broccoli varieties. 【Method】 The full length sequence ofgene was obtained by RACE cloning (5′ and 3′). According to the software of DNAMAN 6.0, gene splicing, amino acid sequence analysis and protein secondary structure prediction ofgene, at the same time, bioinformatics information was also predicted by online program and software. The quantitative real-time PCR (qRT-PCR) method was used to study the expression ofgene in different developmental organs of broccoli. The sulforaphane contents of different developmental organs were detected by high performance liquid chromatography (HPLC) method, and they were roots, stems, leaves, developmental buds at bolting stage (top buds, mature buds, buds one day before flowering and flowers), and seeds.analysis was carried out by the software SPSS 10.0.【Result】Full length sequence ofgenewere cloned, and the gene ofwas 2 014 bp in length, containing a 1 620 bp opening reading frame (ORF), encoded a polypeptide of 540 amino acids. They shared over 95% identity with the homologous proteins fromplants, such as cabbage, Chinese cabbage, Chinese kale and rapeThe bioinformatics analysis showed that the CYP79F1 protein was hydrophilic protein with two signal-peptides and two transmembrane regions, and the Wolf Psort protection indicated that they were located in the cytoplasm. The expression ofgene was higher in the roots and the stems, and the lowest in the leaves. During developmental stage of buds, the expression ofgenewas up-regulated in the early (young buds), and then decreased (mature buds to flowers). There was no difference significance in gene expression between roots, stems, leaves, developmental buds at bolting stage and seeds. Correlation analysis showed that the expression level ofgeneshowed an extremely significant positive correlation with sulforaphane content in developmental buds at bolting stage (=0.96，<0.05), and the expression ofgenemight influence the generation of sulforahane in different organs of broccoli, especially in developmental buds.【Conclusion】Thegenewere comprehensively obtained and characterized from broccoli,mayplay an important role in sulforaphane metabolism and revealing the diversity of sulforaphane content in different organs of broccoli.

broccoli; sulforaphane;;expression analysis; HPLC

2017-10-24；

2018-01-15

國家自然科學基金（31372067，31501761）、國家大宗蔬菜產業技術體系（CARS-23-A）、中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-IVFCAAS）

李占省，E-mail：lizhansheng@caas.cn。

劉玉梅，E-mail：liuyumei@caas.cn